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1、Cyclin D1在口腔癌中的表达与肿瘤生长率及预后的关系 作者：李立 刘义 吴科锋 吕应年【摘要】 目的 调查Cyclin D1表达与口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)肿瘤生长率及临床预后之间的关系。方法 来源于外科手术的诊断用组织切片接受了Cyclin D1蛋白免疫组化染色，并实施Ki67染色用以定量癌组织肿瘤生长率。结果 Cyclin D1表达于24例新辅助化疗组病例中的22例(91.7%)及24例单纯外科手术组病例中的23例(95.8%)。染色密度既与淋巴结转移无关，也与Ki67表达无关。KaplanMeier分析显示在Cyclin D
2、1表达与新辅助化疗病例及单纯外科手术病例的总生存率之间存在密切关系(P0.05,P0.001)。结论 Cyclin D1在OSCC中具有预后意义。 【关键词】 PICC； 肠癌化疗头颈部鳞癌最重要的预后判断因素为TNM分期，而淋巴结转移最为关键1。可是，由于肿瘤的生物学特性经常变化从而导致了尽管分期相同但临床疾病过程趋异。因此，近年来鉴别与临床进展相关的分子及生物预后因子的研究已被广泛开展。Cyclin D1作为调控细胞周期的分子标志物，常在头颈部鳞癌中过表达，提示该基因异常可能在口腔癌的发生发展过程中扮演了一个重要角色并可能充当独立的预后指标。在本研究中，检测了48例OSCC内的Cyclin
3、 D1免疫表达情况，除了分析其与Ki67标记指数所代表的肿瘤生长率之间是否具有相关性外，重点评价了Cyclin D1蛋白表达水平对OSCC患者预后生存的影响。1 资料与方法1.1 资料标本来自作者所在大学附属医院1991年12月2002年5月手术切除经病理证实的OSCC病例。根据术前治疗方法不同，将病例分为两组：新辅助化疗组24例，男性16例、女性8例，年龄(平均64.513)岁，原发灶于舌15例、上龈1例、下龈4例、口底3例、颊黏膜1例，局部淋巴结转移15例，术前化疗药物为cisplatinum(CDDP)或5FU。化疗结束46 w后，病例均行外科切除手术。单纯外科手术组病例24例，男性15
4、例、女性9例，年龄(平均65.78.2)岁，原发灶于舌7例、上龈3例、下龈8例、口底3例、颊黏膜3例，局部淋巴结转移10例，该组病例除接受外科摘除手术治疗外未接受任何其他治疗。患者术后均跟踪随访。在本研究中，手术切除病理组织标本经10%福尔马林固定，制成石蜡包埋4 m厚切片。1.2 试剂鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体购自德国IBL公司，鼠抗人Ki67单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，二抗为抗鼠抗体及ABC试剂盒购自丹麦DAKO公司。1.3 免疫组化切片脱蜡后浸于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)内，微波炉加热至沸腾，并保持该状态15 min修复抗原；切片冷却后，浸于
5、含0.3%H2O2的甲醇中灭活内源性过氧化物酶；PBS洗涤，2.5脱脂乳封闭后不洗，滴加鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体(1500)，4过夜；PBS洗涤，加生物素标记二抗(1100)，室温下反应2 h； PBS洗涤，滴加ABC试剂，室温下反应50 min；PBS洗涤，DAB显色，苏木精轻染，二甲苯透明，封片。Cyclin D1染色后，另取切片以同样方法对Ki67蛋白进行染色，Ki67抗体稀释倍数为1100。1.4 结果判定在200倍镜下，每张切片选4处不同视野，辨别阳性细胞与阴性细胞。Cyclin D1表达阳性的细胞占肿瘤细胞总数的百分比定义为Cyclin D1标记指数(labeling i
6、ndex，LI)，同样Ki67表达阳性的细胞占肿瘤细胞总数的百分比定义为Ki67 LI。1.5 统计学处理采用SPSS 12.0软件系统的成组t检验、Pearson相关分析、 2检验及KaplanMeier法Log Rank检验。2 结果2.1 Cyclin D1在OSCC手术切除癌组织内的表达在癌组织，Cyclin D1表达阳性的细胞核被染成棕黄色(图1)。24例新辅助化疗者中有22例Cyclin D1表达阳性，阳性表达率为91.7%，平均Cyclin D1 LI为10.3%10.6%；24例单纯外科手术病例中有23例Cyclin D1表达阳性，阳性表达率为95.8%，平均Cyclin D1
7、 LI为10.5%10.6%。在两种治疗方法间，Cyclin D1表达无显著差异(P0.05)。2.2 Ki67在OSCC手术切除癌组织内的表达在癌组织，Ki67表达阳性的细胞核为棕黄色(图1)。48例OSCC内均有Ki67表达，阳性表达率为100%。24例新辅助化疗者平均Ki67 LI为41.2%15.6%；24例单纯外科手术病例则为48%16.1%。在两种治疗方法间，Ki67表达无显著差异(P0.05)。2.3 在OSCC内Cyclin D1 LI与Ki67 LI所代表的肿瘤生长率之间的相关性无论是在新辅助化疗病例手术切除癌组织内还是单纯外科手术病例手术切除癌组织内，Cyclin D1 L
8、I与Ki67 LI间均不存在相关性(r=-0.01，P0.05；r=-0.121，P0.05)。2.4 Cyclin D1与OSCC淋巴结转移之间的关系在新辅助化疗组，以该组Cyclin D1 LI平均值为分割点，未确认到高于该值者与低于该值者在淋巴结转移上存在差异(P0.05)；同样，在单纯外科手术组也未确认到Cyclin D1表达与淋巴结转移有关(P0.05)。2.5 Cyclin D1与OSCC患者5年生存之间的关系无论是在新辅助化疗组还是在单纯外科手术组，分别以两组Cyclin D1 LI平均值为分割点，均发现低于平均值者术后生存更佳(P0.05；P0.001)(图2)。3 讨论 口腔
9、癌的发病是一个多步骤过程，在该过程中有610个基因事件使正常的调控细胞分裂、细胞分化及细胞死亡的基本功能陷入瓦解。近年来，在口腔癌的发展中某些抑癌基因及癌基因的表达变化已被报道，其中两个最为瞩目的基因为视网膜母细胞基因(retinoblastoma gene，Rb)及p53基因2，3。几个控制点可调控不同细胞周期的转换，其中，通过包括p16、Rb及Cyclin D1等基因产物在内的Rb通路蛋白可控制G1S转换25，低磷酸化形式的Rb蛋白在G1期可阻滞细胞循环。Cyclin D1基因(定位于染色体11q13)编码蛋白与Cyclin依赖激酶类(CDKs)CDK4及CDK6形成一个复合物，该复合物(
10、Cyclin DCDK4/CDK6)在G1S转换期间使Rb蛋白磷酸化，从而使转录因子E2F脱离与Rb的结合并导致DNA复制的开始2，6。Cyclin D1过表达可促进G1期进程，使细胞加速进入S期，而且该种细胞增殖对生长因子的依赖性低7。在包括头颈部鳞癌在内的人类肿瘤内，Cyclin D1过表达均有报道，并且该表达与肿瘤细胞分化、浸润生长方式及转移有关。 Wang等8的研究显示Cyclin D1蛋白表达与舌鳞癌淋巴结转移之间存在一个具有统计学意义的关系，Myo等9也证实Cyclin D1基因异常与口腔鳞癌淋巴结转移有关。在本研究中，未能确认到Cyclin D1表达与淋巴结转移之间存在任何具有统
11、计学意义的关系，Maahs等10的研究也得出了相似的结果，提示Cyclin D1表达与口腔癌淋巴结转移之间的关系仍存在争议。关于Cyclin D1表达与口腔癌患者预后生存之间的关系，包括本研究在内，最近的研究11，12均显示出Cyclin D1表达异常可显著缩短口腔癌患者的无病生存期或总生存期，提示Cyclin D1过表达使Rb蛋白磷酸化从而导致肿瘤细胞增殖失控，并最终影响口腔癌临床结果。 另外，鉴于Cyclin D1与细胞增殖之间的密切关系，本研究检测了Cyclin D1表达与Ki67表达之间的关系。除了在静息细胞外(G0)，Ki67抗原在细胞周期的各相均有表达。在细胞周期进行过程中Ki67
12、表达提高，由S期后段升至G2和M期则达到峰值，并在有丝分裂后迅速降解，该抗原的半衰期为1 h或更少。一些研究采用抗体识别Ki67核抗原，证明该方法为评价肿瘤生长率的一个可靠方法13。研究证实Cyclin D1与Ki67在口腔癌中的表达具有相关性14，但本研究未能确认到二者间存在显著性关系，提示多基因参与口腔癌发生发展过程的复杂性。 综上所述，尽管Cyclin D1过表达的确切机制及其转录后的角色仍然未明，但可以肯定其在肿瘤发生发展中，尤其在肿瘤发展的晚期扮演了一个重要角色。通过对Cyclin D1的深入研究，将有利于OSCC的发生、发展机制的阐明，极可能为OSCC诊断、预后提供一种新的肿瘤标记
13、物，并且有望使其成为OSCC治疗上的一个新靶点。【参考文献】 1 Salesiotis AN，Cullen KJ.Molecular markers predictive of response and prognosis in the patient with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck：evolution of a model beyond TNM stagingJ.Curr Opin Oncol，2000；12(3):22939.2 Michalides RJ.Cell cycle regulators：me
14、chanisms and their role in aetiology，prognosis，and treatment of cancerJ.J Clin Pathol，1999；52(8):55568.3 Marshall CJ.Tumor suppressor genesJ.Cell，1991；64(2):31326.4 Weinberg RA.The retinoblastoma protein and cell cycle controlJ. Cell，1995；81(3):32330.5 Sherr CJ.Cancer cell cyclesJ.Science，1996；274(5
15、293):16727.6 Kudo Y，Takata T，Nikai H,et al.p27Kip1 accumulation by inhibition of proteasome function induces apoptosis in oral squamous cell carcinoma cellsJ.Clin Cancer Res，2000;6(3):91623.7 Kuo MY，Lin CY，Chiang CP,et al.Expression of cyclin D1 is correlated with poor prognosis in patients with areca quid chewingrelated oral squamous cell carcinomas in TaiwanJ.J Oral Pathol Med，1999；28(4):1659.8 Wang L，Liu T，Okada N,et al.Activation of ERK1/2 and cyclin D1 expression in oral tongue
