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1、不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响 作者：毛平，许力，莫文健，应逸，许艳丽，林秀梅【摘要】 为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34+细胞数及CD34+CXCR4+，CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位(CFU)数.根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组;SF组（SCF+FL）; SFT组（SCF+FL+TPO）和SFT6组(SCF+FL+TPO+IL-6)。结果表明
2、，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF/FL/TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P>0.05）；SF，SFT和SFT6 3组的细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P>0.05）。结论： SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干/祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著;SCF/FL/TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。 【关键词】 脐血Effect
3、 of Different Cytokine Combinations on the Expression of CD49d and CXCR4 and Ex vivo Expansion of Umbilical Cord Blood Mononuclear CellsAbstract This study was purposed to explore the effect of different cytokine combinations on the expansion of the mononuclear cells drived from umbilical cord blood
4、 （CB） ex vivo and expression of CXCR4 and CD49d on CD34+ cells after expansion.Human fresh CB mononuclear cells were cultured in serum-free and stroma-free medium containing different combinations of cytokine for 7 days.At day o and 7，the total cells were counted，CD34+ cells and CD34+CXCR4+，CD34+CD4
5、9d+ cells were assayed by flow cytometry，and CFU were determined.According to the different combinations of cytokine，experiments were divided into four groups: control，SF group (SCF+FL)，SFT group (SCF+FL+TPO) and SFT6 group (SCF+FL+TPO+IL-6).The results showed that the SF (SF group) combination supp
6、orted only low expansion of total cells，CD34+ cells and CFU.The addition of TPO in SF group restored UCB stem/progenitors expansion to a higher level than that in SF group，while there was no difference between groups SFT and SFT6 (P>0.05).The cytokine combinations in groups SF，SFT and SFT6 all co
7、uld upregulate the expression levels of CD49d and CXCR4 on expanded cord blood CD34+ cells，but there were no significant differences between groups SF，SFT and SFT6 (P>0.05).It is concluded that SCF+FL has no strong synergistic effects on primitive hematopoietic cells.TPO plays an important role i
8、n enhancing expansion of umbilical cord blood hematopoietic cells，while IL-6 only shows a neutral effect on it.SCF+FL+TPO combination not only promotes progenitor cells expansion but also upregulates the expression of CD49d and CXCR4 on CD34+ cells from cord blood.Key words umbilical cord blood; cyt
9、okine combination; expansion ex vivo; mononuclear cell; CD49d; CXCR4脐血作为一种新的造血干祖细胞来源，目前已广泛的用于临床造血干细胞的移植，但是，由于单份脐血细胞所含的造血干细胞数量较少，且移植后中性粒细胞和血小板较骨髓和动员的外周血移植后恢复慢1，而体外扩增脐血细胞有望能解决这一问题。因此，对脐血造血祖细胞体外扩增已成为血液学研究的热点。理想的扩增方案应该能够促进造血祖细胞的增殖能力并且扩增后的细胞能够归巢到造血微环境和重建造血，这些与扩增体系中的细胞因子的选择和组合、扩增之后脐血细胞归巢和迁移能力有很大关系。本实验比较了不
10、同因子组合对脐血造血祖细胞的扩增效率和扩增后归巢相关受体的变化，以确定最佳的细胞因子组合，为扩增脐血临床应用提供理论基础。 材料和方法标本的收集和制备10份脐血标本来源于本医院妇产科，采自健康正常分娩的胎盘组织，平均采集量为50-110 ml，肝素抗凝，24小时内用羟乙基淀粉（脐血羟乙基淀粉=51）混合，沉淀30-45分钟，吸取上层细胞，加在含人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque 1.077 ）的10 ml离心管中（脐血人淋巴细胞分离液约=21），1800-2000转/分，离心25分钟，吸取细胞膜层部分，用PBS洗2次，用IMDM去黏附，2小时后调整细胞浓度备用。细胞因子及实验分组干
11、细胞因子（SCF），FLT3配基（FL），血小板生成素（TPO），白介素-6（IL-6），均购于Peprotech公司。SCF、FL、IL-6终浓度为50 ng/ml，TPO终浓度为20 ng/ml。根据不同细胞因子组合实验分组为：空白对照组，SF组（SCF+FL），SFT组（SCF+FL+TPO），SFT6组(SCF/FL+TPO+IL-6)。脐血MNC体外培养StemspanTM培养液(Stemcell公司产品)含1%的BSA，10 g/ml胰岛素，200 g/ml转铁蛋白，10-4 mol/L 2-ME，2 mmol/L L-谷氨酰胺及IMDM。脐血MNC以终浓度为1106接种于25 m
12、l培养瓶，培养体系为6 ml，置于37、5% CO2饱和湿度条件下培养7天，培养第3天半量换液，于0，7天检测各项指标。造血祖细胞集落培养MethoCultTMGF(H4434)(Stemcell公司产品)含1%甲基纤维素，30% FB，1% BSA，10-4 mol/L 2-ME， 50 ng/ml rhSCF，50 ng/ml GM-CSF，10 ng/mlrh IL-3，3 U/ml rhEPO，造血祖细胞集落培养14天后于倒置显微镜下记数CFU 数。流式细胞术检测流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司FACS Vantage产品，使用CellQuest软件系统进行分析，用
13、于人CD34+，CXCR4+，CD49d+细胞检测的单克隆抗体分别为APC标记的抗CD34单克隆抗体，FITC标记的抗CD49d单克隆抗体，PE标记的抗CXCR4单克隆抗体。统计分析运用SPSS统计软件包分析，数据采用均数标准差表示，组间比较采用方差分析。结果体外扩增过程中有核细胞数及CD34+细胞数，CFU数扩增倍数的变化经过7天培养，对照组有核细胞数及CD34+细胞数均较0天下降，而CFU数略高于0天，SF组中有核细胞数，CD34+细胞数，CFU数分别增加至（10317），（21956）和（25996），SFT组分别中增加到（308161），（569281）和（449141）。培养7天后，
14、SFT6组中有核细胞数和CD34+细胞数，CFU数也分别增加到（274128），（585251）和（535241）。SF、SFT、SFT6 3组组间比较，SFT组扩增效果优于SF组(P<0.05)，但SFT组和SFT6组之间差异无显著性 (P>0.05)。SF、SFT、SFT6 3组与对照组相比，差异有显著性 (P<0.05)（表1 ） 。Table 1.Increment of the absolute numbers of TNC，CD34+ cells and CFU on day 7 of culture in different growth factor comb
15、inations(略)体外扩增过程后CD49d和CXCR4表达的变化培养7天，对照组CD34+CXCR4+，CD34+CD49d+的细胞数均较0天下降，SF组，SFT 组，SFT6组CD34+CXCR4+，CD34+CD49d+的细胞数分别较0天扩增到(6353)%和(309162)，(20481)%和(432214)，(22872)%和(413164)，和对照组相比，SF组、 SFT 组、 SFT6组的扩增效果均优于对照组，差异有显著性（P<0.05），但SF组，SFT 组，SFT6组 3组之间差异均无显著性（P>0.05）（表2）。Table 2. Increment of t
16、he absolue numbers of CD34+CXCR4+，CD34+CD49d+ cells after expansion of CB ( 略)讨论目前，国内外许多学者多使用分离纯化的CD34+细胞作为扩增培养的起始细胞，但是在分离纯化CD34+细胞的过程中不可避免造成干/祖细胞的损失，对于象脐血这样采集到的细胞数有限的移植物而言，最后的总细胞产量将受到明显影响。因此，对于体外扩增脐血细胞，分离纯化CD34+细胞似无必要，且大多数黏附分子像CD49d，CD44，CXCR4不仅存在于早期造血细胞上，而且也存在于像单个核细胞和淋巴细胞这些有核细胞上。所以，CD34+细胞和其他的有核细胞都表
