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1、rhBMP2对成纤维细胞成骨表型的影响 作者：孟国林，胡蕴玉，蒲勤，袁志，吕荣，白建平 【关键词】 成纤维细胞 关键词: 成纤维细胞;骨形态发生蛋白;表型 摘 要:目的 研究rhBMP-2对成纤维细胞成骨表型的影响，探讨成纤维细胞成骨条件. 方法 向体外培养的成纤维细胞（NIH3T3细胞）内加入不同浓度的rhBMP-2，在第3日和第6日检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素表达，绘制生长曲线. 结果 rhBMP-2可增加成纤维细胞ALP活性，促进骨钙素表达，在rhBMP-2浓度为800g・mL-1 和1200g・mL-1 作用最强.rhBMP-2对细胞增殖规律无明显影
2、响. 结论 rhBMP-2可促进成纤维细胞成骨表型表达. Keywords:fibroblast;bone morphogenetic protein;pheno-type Abstract:AIM To investigate the effect of rhBMP-2on os-teogenic phenotype of fibroblast and discuss the condition that facilitates osteogenesis of fibroblasts.METHODS rhBMP-2in different concentration was added to
3、 the cultured cells.ALP activity and expression of osteocalcin were detect-ed at the3rd day and the6th day and the effect of rhBMP-2on proliferation of the fibroblasts was observed.RESULTS rhBMP-2increased the activity of ALP and stimulated the ex-pression of osteocalcin.With the effect being the st
4、rongest when the concentration of rhBMP-2was800g・mL-1 and1200g・mL-1 .rhBMP-2had no effect on proliferation of fibroblasts.CONCLUSION rhBMP-2could stimulate the expression of osteogenic phenotype of fibroblasts in vitro. 0 引言 组织工程学由三个要素组成，即:种子细胞、调节细胞生长与增殖的细胞因子和支持细胞生长的细胞外基质.在骨组织工程学的研究中，种
5、子细胞来源可有较多选择，而成纤维细胞因在体内存在范围广泛、取材方便、容易培养而得到研究者的重视.但在何种条件下成纤维细胞可向成骨细胞方向转化，目前研究不多.本研究旨在探索在rhBMP-2作用下成纤维细胞成骨表型的变化. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM、小牛血清、牛胰蛋白酶（华美公司）;rhBMP-2（本校生物化学教研室提供）;碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（广东佳标生物制品公司）;骨钙素放射免疫检测试剂盒（北京东亚免疫技术研究所）;Heraus细胞培养箱（德国）;Hitach2006型紫外分光光度计（日本）;-射线检测仪（美国Capintec Inc）.NIH3T3细胞由本校口腔医学院
6、口腔生物教研室提供，DMEM/200mL・L-1 小牛血清（DMEM/200mL・L-1 BS），50mL・L-1 CO2 ，37培养，2.5g・L -1 牛胰蛋白酶消化传代，按2103 /孔传代至96孔培养板内，同一条件下培养. 1.2 方法 1.2.1 rhBMP-2对成纤维细胞的作用 将rhBMP-2溶解于DMEM中，针头滤器过滤除菌，质量浓度为10g・L-1 ;细胞传代24h后，向每个培养孔内添加rhBMP-2，并使其终质量浓度分别为0，100，200，400，800，1200和1600mg・L-1 ，
7、分别在培养3和6d停止培养，检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素表达.各组培养的细胞在培养过程中每日计数细胞的数量，并绘制细胞生长曲线.培养的细胞同时行光镜观察. 1.2.2 ALP活力的检测 将培养至3和6d的细胞培养孔内培养基吸除，并用0.01mol・L-1 PBS洗涤3次，0.1g・L-1 Triton X-100处理细胞过夜（50L/孔），然后向培养孔内加入ALP缓冲液100L/孔，37保温25min，加入显色剂100L/孔，37处理5min，紫外分光光度计上检测其吸光度，并绘制直方图.培养的细胞同时行钙-钴法ALP染色. 1.2.3 骨钙素表达的检测 按照
8、试剂盒操作说明操作，将-计数仪测量结果绘制标准曲线. 2 结果 2.1 成纤维细胞形态学 正常成纤维细胞（NIH3T3）为长梭型，细胞突起较少，细胞内颗粒也较少.在rhBMP-2作用下，细胞形态发生明显变化，表现为细胞突起增多，胞体增宽、增大，细胞内颗粒状物质增多.钙-钴法染色显示细胞内的颗粒为碱性磷酸酶颗粒.亦即说明在rhBMP-2作用下，细胞内ALP颗粒增多. 2.2 成纤维细胞ALP活性 正常成纤维细胞内有一定水平ALP的表达.在rhBMP-2作用下，细胞ALP活力明显增高，随着rhBMP-2质量浓度的增加，ALP活力逐渐增强;当rhBMP-2质量浓度为1200g・L-1
9、时对ALP活力促进作用最大.随着时间的延长，成纤维细胞ALP活性有所增加（Fig1），考虑到细胞数量的增加，所以rhBMP-2对ALP的促进作用可能并不一定随着时间的延长而增强.在细胞培养3d更换培养液时如不再加入rhBMP-2，结果发现，6d时其ALP活性较同组加入了rhBMP-2的细胞的ALP活性为低.以上证明，成纤维细胞ALP活性的变化是在外源rhBMP-2影响下出现的细胞表型的变化. 2.3 成纤维细胞的增殖 每个培养孔内加入细胞量为2103 /孔，DMEM/200mL・L-1 BS，50mL・L-1 CO2 ，37培养条件下，正常成纤维的增殖周期为6d;在
10、使用rhBMP-2的每个组中，细胞的增殖周期没有明显的变化，细胞生长过程中的计数无明显的差别，说明rhBMP-2对成纤维细胞的增殖无明显影响. 2.4 成纤维细胞骨钙素的表达 正常成纤维细胞内有一定量的骨钙素表达，但表达量较低.rhBMP-2对成纤维细胞内骨钙素表达具有一定促进作用.随着rhBMP-2剂量增加，细胞内骨钙素表达量逐渐增加，在rhBMP-2浓度为800mg・L-1 和1200mg・L-1 时，对骨钙素表达的促进作用最大（Fig2，3）. 3 讨论 在骨折愈合早期，成纤维细胞形成纤维骨痂将断骨片固定在一起.此外，成纤维细胞还可为钙盐沉积提供钙的来源.在骨
11、折后第二周左右，一部分成纤维细胞发生变形、死亡，其原来位置为骨细胞所替代，而另一部分成纤维细胞四周的钙化基质小泡或钙化胶原纤丝不断融合成为骨组织，并形成骨陷窝，于是成纤维细胞演变为骨细胞1，6 .基于成纤维细胞在骨折愈合过程中的表现，该细胞被认为具有一定的成骨能力，并被认为是骨组织工程中成骨细胞来源之一的种子细胞.但成纤维细胞的成骨能力是有条件的，即必须在一定的条件影响下才表现出成骨特征. 在骨折愈合过程中，骨折断端的间充质细胞、成软骨细胞和成骨细胞等可表达内源性BMP，内源性BMP可作用于未分化间充质细胞等靶细胞，促进其向成骨细胞方向转化，从而促进骨折的愈合2，7 .那么，骨折愈合过程中BM
12、P是否也作用于成纤维细胞而促进其成骨表型的表达呢?有关该方面的研究较少.我们的实验证明，BMP-2可促进成纤维细胞ALP和骨钙素的表达，促进其细胞的表型向成骨细胞方向转化.在成纤维细胞的细胞膜上存在BMP的受体3 ，BMP可通过细胞膜上的受体而促进成纤维细胞的表型变化.据此我们认为，在骨折愈合过程中，BMP高表达细胞所分泌的BMP通过自分泌/旁分泌方式，不但可刺激骨折断端骨膜中成骨细胞及周围间充质细胞的增殖和分化，同时也作用于周围的成纤维细胞，促进其向成骨细胞方向转化并最终参与形成新骨.成纤维细胞在体内分布广泛，在结缔组织中含量丰富.将BMP植入肌肉组织中时，可在异位诱导形成新骨3-7 .以往
13、的理论解释为:BMP作用于肌肉组织中的未分化间充质细胞从而诱导新骨形成.根据本实验结果可间接说明，在成骨过程中，在BMP的作用下，成纤维细胞也可能发挥着重要的作用. 骨组织工程研究中，如何促进种子细胞向成骨细胞方向转化并有效成骨是需要解决的课题之一.我们的实验表明，通过将BMP与细胞支架有效复合，使工程支架逐渐向周围缓释BMP，或通过将外源 BMP基因转染成纤维细胞，使其表达BMP，从而长 期持续表达成骨活性并最终形成骨组织，将成为骨组织工程研究中种子细胞的重要内容之一. 参考文献: 1Cai BF，Tang XM.Study on the supermicro-structure of th
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15、（5）:585-588. 3Hoshi K，Amizuka N，Sakou T，Kurokawa T.Fibroblasts of spinal ligaments pathologically diffeerentialte into chondrocytes induced by recombinant human bone morphogentic protein-2:Morphological examinations for ossification of spinal ligaments J.Bone，1997;21:155-162. 4Hu DH，Chen B，Tang CW，Xu MD，Jia CY.Biological effects of pcDNA-3-hbFGF modified human keratinocytes on the pro-liferation of human dermal fibroblastes J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:395-398. 5Si XH，Jin Y，Yang LJ.Experimental study of stimulation of perioste
