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1、食品卫生微生物学指标,食品卫生标准,是检验食品卫生状况的依据，包括,目前实际应用的指标菌可以分为以下三种： 一、一般卫生状况指标菌，包括菌落总数、霉菌和酵母菌总数； 二、粪便污染指标菌，包括大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、霍乱弧菌等； 三、致病菌，包括金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌等。,食品卫生标准中的微生物指标,菌落总数,菌落总数 指食品检样经处理，在一定条件下培养后，所得1g食品或1mL食品中或1cm2食品表面积上所含有的细菌菌落总数。,1.1菌落总数概念和其所指示的卫生意义,一定条件：如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等 不能满足厌
2、氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌的生长 因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类 单位菌落形成单位叫做CFU（colony forming units）,菌落总数所指示的食品卫生意义 ：,它可以作为食品被污染程度的标志，一般食品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越深。,它可以用来预测食品存放的期限或程度。,检测方法与步骤,平板菌落计数法 基本操作一般包括： 样品的稀释倾注平皿培养48小时计数报告。,GB中国国家标准 SN 中国检验检疫行业标准 FDA BAM(Bacteriological analytical manual) 美国食品药品管
3、理局细菌学分析手册 ISO(International Organization for Standardization )国际标准化组织 AOAC国际分析化学家协会,细菌总数的常规检验方法,-样品的稀释 -倾注平皿 -培养48（24）小时 -计数 -报告,稀释平板菌落计数法(Plate Counter),操作步骤,稀释平板菌落计数法,稀释液的选择,样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。,培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多
4、采用30） 培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别,培养条件,平板计数琼脂培养基（PCA）,胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml， pH7.00.2, 12115分钟灭菌。,若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。,计数
5、原则,到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,中国国家标准GB计数时应选取菌落数在30300cfu/g的平板（SN检验检疫行业标准要求为25250cfu/g）。,如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。,若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。,如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,不
6、同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。,当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时）
7、，但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,菌落数的报告,按国家标准方法规定 菌落数在1100时，按实有数字报告。 如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。 固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,方法优点,方法简便，较精确，重复性好。,细菌总数的其它检验方法,涂布平板法 点滴平板法 螺旋平板法：螺旋平板法是由一台机器完成的。,涂布平板法,是将营养琼脂制成平板、经5012小时或351820小时干燥后，在上面滴加检样稀释液0.2ml，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约
8、10分钟，将平板翻转，放至36+1温箱内培养242小时，（水产品用30C培养482小时)取出，进行菌落计数，然后乘以5(由02ml换算为1ml)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样所含菌落数。,涂布法优缺点,比常规检验法效果好。因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆但是本法取样量比常规检验法少。 代表性会受到一定影响。,点滴平板法,与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在乎板背面用标记笔划成四个区域)每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作
9、为平行试验。滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转平板，如涂布平板法+样移入温箱中，培养68小时后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0025m1换算为1ml)，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。,螺旋平板仪,粪便污染指示菌类,理想的指示菌应具备的性能,必须与粪便或病原菌有密切关系。它们正常寄居场所应是人或动物的肠道，在正常情况下不应在一般检样中存在。,在普通培养基上易生长，用简单的操作方法即能快速和准确地测定出数量。,它们与肠道致病菌应有相同的对外界不良因素的抵抗力。,大肠菌群,粪便污染指示菌之一 -大肠菌群(coliforms),一、大肠菌群(coliforms)的定义,
10、二、大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的卫生意义,三、大肠菌群计数方法：国家标准法 （一）大肠菌群MPN计数法 （二）大肠菌群平板菌落计数法,大肠菌群,大肠菌群(coliforms)的定义,具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。 指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。 包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等的一些菌种。,分布广泛：土壤、人和动物肠道。,大肠菌群MPN值,指每1g或1ml食品检样中大肠菌群最可能数（most probable number）。,大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的卫生意义：,1.它可作为粪便污染食品的指示
11、菌。,2.它可作为肠道致病菌污染食品可能性的指示菌。,样品稀释 初发酵试验 复发酵试验,大肠菌群计数方法：国家标准法,方法一-大肠菌群MPN计数法：,不产气,产气,图 大 肠 菌 群 M P N 计 数 法 检 验 程 序,样品稀释 平板计数典型和可疑菌落数 证实试验,大肠菌群计数方法：国家标准法,方法二-大肠菌群平板计数法：,图 大 肠 菌 群 平 板 计 数 法 检 验 程 序,计数典型和可疑菌落,10 倍系列稀释,选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种VRBA 平板,检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质,BGLB肉汤,报告结果,36 1 ,36 1 ,18 h 24
12、h,24h 48h,VRBA结晶紫中性红胆盐琼脂培养基 成分：蛋白胨7.0g；酵母膏3.0g；乳糖10.0g；氯化钠5.0g；胆盐或3号胆盐1.5g；中性红0.03g；结晶紫0.002g；琼脂15-18g；蒸馏水1000mL；pH7.40.1。 制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷却至45-50倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。,选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。,大肠菌群在VRBA上的菌落特征,证
13、实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。,乳糖发酵试验 分离培养 证实试验,大肠菌群的检测：旧国家标准-
14、三步法,产气实验,（伊红美蓝） 琼脂培养基原理,琼脂培养基中含有的伊红和美蓝染料，可抑制革兰氏阳性细菌。那些能发酵乳糖的细菌，能将染料摄入细胞，从而使菌落呈现出紫色或边缘无色、中央暗黑色的菌落。,培养基成分,肉汤蛋白胨培养基毫升（h.），乳糖溶液毫升，伊红溶液毫升，.美蓝溶液毫升。,配制方式,将已灭菌的肉汤蛋白胨琼脂培养基熔化 以无菌操作加入预先灭菌的乳糖溶液毫升、伊红溶液毫升及.美蓝溶液毫升。,培养结果观察,大肠杆菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反射光下常常有一种金属光泽（亮绿色） 产气杆菌以粘质状菌落丰盛地生长，呈棕色 一般肠道致病菌不发酵乳糖，故呈粉红色或兰色的菌落,中心黑色或紫红色，有或
15、无绿色金属光泽,粪便污染指示菌之二-粪大肠菌群（faecal coliforms）或耐热大肠菌群,首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。 大肠菌群包括：粪（便）大肠菌群和非粪（便）大肠菌群。,粪大肠菌群（faecal coliforms） 或耐热大肠菌群,粪大肠菌群定义在44.5 条件下发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性兼性厌氧的小杆菌。包含绝大部分大肠杆菌，少数肠杆菌和克雷伯氏菌属的某些品系。 粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5进行，其他所有食品都在45.5进行。,粪便污染指示菌之三-大肠杆菌,是人类和大多数温血动物肠道中的正
16、常茵群 条件致病菌,大肠杆菌，学名为大肠埃希氏菌（ Escherichia coli，E.coli ）,大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。,大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测,大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测,菌落总数和大肠菌群MPN的其他测定方法,疏水网膜法（膜过滤法） TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）显色法 DC(去氧胆酸钠)半固体法 纸片法
