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1、临床免疫学检验技术,第四章 标记物及其与抗原抗体的结合物制备,汪 付 兵,/R20107,目 录,第一节 标记物种类及特性 第二节 常见交联剂的种类及特性 第三节 放射性核素与抗原抗体结合物制备 第四节 荧光素与抗原抗体结合物制备 第五节 酶与抗原抗体结合物制备 第六节 化学发光剂与抗原抗体的结合物制备 第七节 稀土离子与抗原抗体的结合物制备 第八节 量子点与抗原抗体的结合物制备 第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备,第一节 标记物的种类及特性,重点提示,放射性核素 荧光物质 酶和酶作用底物 化学发光剂 量子点 胶体金,第一节 标记物的种类及特性,标记免疫技术 = 免疫技术 + 标记技术,抗原
2、抗体反应,示踪标记物,高特异性,高灵敏性,精密仪器检测,高精密性,既可以与抗原或抗体相结合，又可以被相应的仪器所检测的物质，这就是标记物,标记物在免疫分析中的作用在于示踪标记并能够被检测,一、放射性核素,是指在自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性核素转变为另一种放射性核素，并同时释放射线，这一转变过程称为放射性衰变。 依衰变方式分为：、。,一、放射性核素,常用标记核素,125I 3H 理化性 活泼 差 标记方法 简单 复杂 对标记物 免疫活性的影响 小 大 射线 半衰期 60d 12.3y 测量条件 简单 复杂,放射性核素125I特点,化学性质较活泼，标记方法简单，容易获取高比活性的标
3、记结合物； 衰变过程不产生电离辐射强的射线，对标记多肽，蛋白抗原分子的免疫活性影响小； 衰变过程中释放射线，可用计数器测量，方法简便，易推广应用； 半衰期(60天)适中、核素丰度(95)及计数率相对较高。,二、荧光物质,有机化合物荧光素 稀土离子螯合物 荧光底物（酶作用后产生荧光的物质）,荧光素,异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC） 四乙基罗丹明（rhodamine, RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC） 藻红蛋白(phycoerthrin, PE),常用的荧光素
4、特性,稀土离子,镧系元素属于三价稀土离子，包括铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽(Tb3+)、钕（Nd3+）、镝（Dy3+）和铈(Ce3+)等。 铕是标记抗原抗体应用最广的元素。 游离的稀土离子荧光比较弱，但与适当的螯合剂如-萘甲酰三氟丙酮（-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使荧光得到增强。 稀土离子的荧光特性如下： 具有较大的Stokes位移，发射光谱和激发光谱不会相互重叠。 荧光寿命长，荧光半衰期介于10-1000s之间。 激发光波长范围宽，发射光谱带很窄，甚至不到10nm。,其他荧光物质,某些化合物本身无荧光效应，但经酶催化后便具有强荧光。 如4-甲基伞酮-D半乳
5、糖苷，受-半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲基伞酮，可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。 其他如碱性磷酸酶的底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶的底物（对羟基苯乙酸）等，都具有荧光底物的性质。,三、酶和酶作用底物,常用的酶标记物有 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP) - 半乳糖苷酶(-galactosidase, -Gal),每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光强度对被检物进行定性、定量分析。,辣根过氧化物酶H
6、RP,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,碱性磷酸酶ALP及-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶（AP）,菌源性AP 肠粘膜AP,半乳糖苷酶（-Gal）,用于均相酶 免疫测定,HRP底物,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨
7、酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，HPA） HPA具有荧光底物性质，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光。,H2O2 HRP,+荧 光,氧化二聚体,ALP底物,常用的ALP色原底物 对-硝基苯磷酸
8、盐（p-nitrophenyl phosphate，PNP） 氯化硝基四氮唑蓝/ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（nitro- blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate，BCIP/ NBT） 4-甲基伞形酮磷酸盐（4-methylumbelliferyl phosphate，4-MUP）是ALP的发光底物之一。,ALP的 底物,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,常用底物,BCIP/ NBT常用于ELISPOT中的PVDF膜显色，在ALP的催化作用下，BCIP被
9、水解生成强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀,4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出450nm的荧光，可用荧光光度计进行测量。,荧光,AP,360nm 激发光,H3PO4 +,- Gal 荧光底物,-Gal 的底物,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）,酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计测量。,常用4-甲基伞酮基-D半乳糖（4-methylumbellifery-D-galactoside，4-MUG）作为底物，酶促反应后，产生高强度荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）。,四、化学发光剂,在化学发光反应中参与能量转
10、移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。 直接化学发光剂 酶促反应发光剂,直接化学发光剂,直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,吖啶酯,在碱性条件下与H2O2 就可产生化学发光现象。在碱性介质中氧化时，这些化合物经历共价键的断裂，经过一个二氧酮的中间体，产生电激发的N-甲基吖啶酮，当它恢复到基态时，在430nm出释放出光子。,AE特性,化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。 极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特的结构使其有效期长达1 年甚至更久。 发光过
11、程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内完成。,电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点：反应在电极进行； 电子供体为：三丙胺（TPA） 化学发光剂：三联毗啶钌,三联毗啶钌 分子结构图,电化学发光剂,酶促反应发光剂,酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。,鲁米诺及其衍生物 AMPPD,鲁米诺及其衍生物,鲁米诺发光原理,鲁米诺及其衍生物,鲁米诺增强发光反应原理,AMPPD,AMPPD 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷,五、量子点,量子点 Q
12、Ds,量子点(quantimim dots, QDs)即半导体纳米粒子，是指半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒（1-10nm）。 由II-VI族或III-V族元素组成，性质稳定，可接受激发光产生荧光，具有类似体相晶体的规整原子排布。 广义的量子点还包括 IV-VI 族、V-VI 族元素组成的纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合型荧光纳米颗粒等。,量子点的光学特性,荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强 所谓光漂白是指由光激发引起发光物质分解而使荧光强度降低的现象。有机荧光色素的光漂白速率很快，而量子点的光漂白作用则小得多。 具有“调色”功能，一元激发多元发射 不同粒径的量子点具有不同
13、的颜色，可用同一波长的光激发不同大小的量子点，获得多种标记颜色。 激发光波长宽，而发射光波长窄 量子点的激发光波长范围很宽，具有较大的Stokes位移和狭窄对称的荧光谱峰。,量子点调色功能,在紫外光激发下，相同组成不同粒径的量子点的发射光谱,量子点的制备,大致分为两种方法：物理制备法、化学合成法。 物理制备法 可制得粒径易控的量子点，但所需实验设备昂贵，广泛使用受限。 化学合成法有水相和有机相合成法 有机相体系 可制备性能优良的量子点，如 CdSe及CdSe/ZnS。 量子点分散性好、稳定性高、不易沉积，但水溶性太差。 水相体系 操作简单、成本低廉、量子点表面形貌及性质可控、易修饰各种基团。,
14、量子点表面修饰,无机壳层修饰法和化学修饰法是两种常用的量子点修饰方法。 无机壳层修饰法 合成核/壳结构的量子点，如在CdSe量子点的外面包覆一层CdS 或ZnS 就构成了以CdSe为核，以CdS 或ZnS 为壳的量子点。 化学修饰法 用含巯基的有机分子如二氢硫辛酸、巯基乙酸和聚乙二醇等对量子点进行表面修饰。,六、胶体金,胶体金（colloidal gold）也称金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成(内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷的H+)。 由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带
15、负电的疏水胶溶液，故称胶体金。,胶体金特性,具有胶体的多种特性 特别是对电解质的敏感性，电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体金的稳定状态。 胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同 最小的胶体金(2nm5nm)是橙黄色，中等大小胶体金(10nm20nm)是酒红色，较大颗粒胶体金(30nm80nm)则是紫红色。,胶体金制备原理,胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。 常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等。 根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm150nm不等的胶体金颗粒。,胶体金制备方法
16、,常用的方法为柠檬酸三钠还原法 以制备16nm的胶体金为例，取0.01%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，磁力搅动下加入1%的柠檬酸三钠水溶液2ml，淡黄色的氯金酸溶液很快变灰色，继而黑色，随后成酒红色。,金溶胶颗粒的直径取决于制备时加入的枸橼酸三钠量，保持其他条件不变，制备时加入不同剂量的柠檬酸三钠可获得不同粒径的胶体金颗粒。,第二节 常用交联剂及特性,重点提示,均一的双功能交联剂 非均一的双功能交联剂 交联剂方法,交联剂,生物大分子之间的偶联，本质上是生物大分子中活性基团之间的连接。 其连接类型主要有：-NH2与-NH2 、-NH2与-CO2H 、-SH与-SH 、-NH2与-SH 、糖基(-OH)与-NH2
