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1、I026 福寿螺纤维素酶EGX相关新基因SEGX的发现与解析 谢承佳，欧阳嘉，李霜，潘笑甜，何冰芳* （南京工业大学制药与生命科学学院，南京 210009） 摘摘 要要 福寿螺纤维素酶 EGX 是一种多功能，高比活的糖苷酶。本研究以构建 EGX 高表达的基 因工程菌为目标，在报道的福寿螺纤维素酶 EGX 基因的基础上设计引物，从福寿螺胃中抽提出 总 RNA 后通过 RT-PCR 反应构建 cDNA 文库。由 cDNA 文库我们一共获取了三条不同长度的相 关基因片段，其长度分别为 1232bp，1625 bp 和 1859 bp，通过比对与报道基因不同。在 genebank 中检索，国内外均未见
2、报道。其中， 1232 bp 片段中有一个长为 882bp 的开放阅读框架 （ORF） SEGX，编码 293 个氨基酸。SEGX 与 EGX 对应 ORF 的 C-端序列的同源性为 90.2，其氨基酸 序列与 EGX 对应 ORF 的 C-端氨基酸序列的同源性为 89.5，另外还含有糖苷水解酶第十家族 中通常存在的序列 Asn-Asp-Tyr-Asn。因此推测 SEGX 可能是福寿螺纤维素酶的新基因，但这还 需进一步构建表达以证实该新基因编码蛋白的活性。 关键词关键词 多功能纤维素酶 SEGX 福寿螺 纤维素酶新基因 CLONE AND ANALYSIS OF A NEW GENE SEGX
3、 ENCODING CELLULASE IN AMPULLARIA CROSSEAN XIE Chengjia, JIA Ouyang, LI Shuang, PAN Xiatian, HE Bingfang (College of Life Science and Pharmacy,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China) Abstract Cellulase EGX from Ampullaria crossean is a multi-functional cellulase.In order to express EG
4、X,we cloned cDNA of EGX first and then constructed cDNA library.As a result,we got three different cDNA sequences with the length of 1232bp，1625bp and 1859bp respectivelly,and none were reported.The sequence of 1232bp reveals an opening reading frame of 882bp(SEGX),and consequently encodes 293 amino
5、 acids. By the analysis of the software Vector NTI,The cDNA SEGX displays 90.2% positive to the cDNA sequence reported while the opening reading frame of SEGX displays 89.5% positive to C-termius of EGX. In addition,the amino acid sequence Asn-Asp-Tyr-Asn which is a consensus region in most members
6、of glycosyl hydrolase family 10,is also conserved in 基金项目：973 项目（2003CB7160004） 、国家自然科学重点基金（20336010） *通讯作者： 何冰芳， 教授， 微生物与分子生物学领域， Tel:025-83587336， E-mail:bingfanghe SEGX.In conclusion , SEGX might be a new gene encoding cellulase in Ampullaria crossean,and the construction of expressing vector is
7、demanded to determine the activity of the protein encoded by SEGX. Key words multi-functional cellulase, SEGX, Ampullaria crossean, new gene encoding cellulase 地球上存在着大量的纤维素和半纤维素类物质， 将其转化为简单糖是其作为再生资源的 关键，而纤维素酶和半纤维素酶起着关键的作用。 目前研究较为集中的是真菌和细菌的纤维素酶系。 但是它们的酶系复杂， 给研究和应用 带来极大的困难1-3。另一方面，纯化了的单一组分的纤维素内切酶和外切酶不
8、能水解未经 化学处理的天然纤维素生成水溶寡糖，且水解商品纤维素的活力低4。因此寻找和研究新型 高比活力的纤维素酶一直是该研究领域的焦点问题。 动物来源的纤维素酶正逐步成为该研究领域的重点。 上海生化所王骥， 丁明等从产自厦 门的福寿螺内脏中分离的纤维素酶EGX是一种高比活多功能纤维素酶5， 且还具有其他微生 物纤维素酶所没有的优点，如不受产物抑制等 6。另外，他们还在Pichia pastoris中做了初步 表达5。但由于过糖基化的影响，酶活不高。 本实验以构建 EGX 高表达的基因工程菌为目标，以广西南宁的福寿螺为原材料，在研 究过程中我们一共获取了三条不同长度的相关新基因片段， 经分析推测
9、其中有一条可能是福 寿螺纤维素酶的同功酶。 本研究为具有自主知识产权的福寿螺纤维素酶基因工程菌的构建奠 定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料材料 1.1.1 原材料 本实验所用的福寿螺来自广西南宁 1.1.2 菌株 大肠杆菌 DH5出自本实验室。 1.1.3 试剂 PCR 反应试剂、Taq DNA 聚合酶及 DNA Marker 均为大连宝生物公司产品；蛋白胨、 酵母粉均购自 Oxoid 公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。 1.2 实验方法实验方法 1.2.1 相关基因的获得 取福寿螺胃两只，使用Sangon公司的“UNIQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒” 进行 总RNA提取
10、。以抽提出的总RNA为模扳，使用TAKARA公司的“M-MTV RTase cDNA合成 试剂盒”合成cDNA第一链。以梯度 PCR摸索目的基因合适的扩增条件，模扳为刚合成的 cDNA第一链，变性温度为 60(2)，延长时间为 1min20sec，30 个循环后电泳分析扩增 情况。PCR所用引物是根据上海生化所报道的EGX全序列5所设计。因本论文暂未发表，故 此不公开引物序列。 1.2.2 EGX 相关基因 pMD18-T 克隆载体的构建 电泳后的琼脂糖凝胶用 Promega 公司的“胶回收试剂盒”回收 DNA 片段。 将纯化后的目的片段和 pMD 18-T Vector 进行连接，连接液 1
11、6静置 3h。使用新制备 的大肠杆菌 DH 5进行转化。 图图 1 克隆载体克隆载体 pMD 18-T 图谱图谱 1.2.3 重组质粒的鉴定 转化液涂布于 LB（X-gal/IPTG/Amp）固体培养基上， 37培养 16hr 后出现明显蓝白 菌落7。根据互补7的原理挑选白色菌落进行质粒快检7，将可能转化成功的菌挑取菌 泥作 PCR 检测。将初步鉴定的阳性克隆应用引物 M13 测序，测序由大连宝生物公司及上海 博亚生物公司共同完成。 2 结果与讨论 2.1 电泳检测电泳检测 RT-PCR 结果结果 RT-PCR 电泳检测结果见图 2。 PCR 产物在报道基因片段长度处（1.3kb）及 1.81
12、.9kb 有明显条带，在 2.02.1kb 有 较弱条带；即使是在较高退火温度下（62）这三条带依然很清晰，说明这三条片段与引物 的特异性很高。 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 图图 2 电泳检测电泳检测 RT-PCR 结果结果 Lane 1 Marker DL2000 Lane 2 阳性对照 Lane 3-12 RT-PCR 扩增条带 2.2 序列测定序列测定 对重组的质粒进行 PCR 鉴定后， 即对插入基因片段进行测序。 得到长度分别为 1232bp， 1625 bp 和 1859 bp 的三条序列。 2.3 基因解析基因解析 考虑到与所报道基因所用福寿螺的产地不同，
13、因此并不排除福寿螺种群之间基因的差 异。此外，在得到的三条序列中，除了某些类似于内含子的片段的缺失，其他部位的相似性 都很高。由于真核生物对新合成的 mRNA 会采取不同的剪切方式，因此推测这三条序列可 能是由于不同剪切方式造成的。 由 Vector NTI 分析所得的三条序列， 其中， 1232bp 的开放阅读框架为 882bp， 编码 293 个氨基酸， 暂命名为 SEGX （882bp） . SEGX 与 EGX 对应 ORF 的 C-端序列的同源性为 90.2 ，Vector NTI 分析图谱见图三。SEGX 的起始密码子 ATG 比 EGX 的起始密码子滞后 309 个核苷酸，共少编
14、码 102 个氨基酸。1625bp 和 1859bp 序列的氨基酸序列中有较多终止子， 无较大有效阅读框。 SEGX与EGX开放阅读框架C-端氨基酸序列（EGX的从第 104 位氨基酸开始比较）的相 似性为 89.5。另外，在糖苷水解酶第十家族8中通常存在的序列Asn-Asp-Tyr-Asn在SEGX 所编码的氨基酸序列中也存在。 SEGX 编码的氨基酸序列与 Penicillium simplicissimum(GeneBank No:AF070417)的木聚 糖酶有 28.4的相似性， 与 Thermoascos aurantiacus （AF127429） 的耐热性木聚糖酶有 27.3
15、的相似性，与 Streptomyces lividans（M64551）的木聚糖酶的相似性为 22.9，与 Cellulomonas fimi(M15824)的内切-1，4-木聚糖酶/外切-1.4-葡聚糖酶的相似性为 22.1 。而 EGX 的 C-端氨基酸序列与上述酶的相似性分别为 27.3，25.6，23.0，20.3。 另外,可能作为催化亲核体和质子供体的残基被保留了。 在保守序列Thr-Glu-Leu-Asp中， Glu166 可能是亲核残基9。在保守序列Trp-Asp-Val-Asn-Asn-Glu中，Glu64可能起着广义酸碱 的催化作用10。 +1 0 1200400600800
16、 Absolute Complexity (1 229 a -u22) +1 0 -9 0 1200400600800 Absolute Complexity +1 1200400600800 Similarity 图三图三 SEGX 与与 EGX 对应对应 ORF 的的 C-端序列比较图端序列比较图 另一方面， 软件signalP V2.0 分析认为， 无论是我们所得的SEGX还是所报道的EGX序列 都不存在典型的N-端信号肽，不是明显的分泌型蛋白。但是，有文献报道厌养菌Clostridium thermocellum 的内切葡聚糖酶CelC也不认为是分泌型蛋白，但这种酶仍能分泌到培养基中， 分泌机制尚不清楚11。因此，信号肽的存在与否和分泌可能性之间的关系仍需要进一步的 实验论证。 3 结论与展望 由上述分析， 本实验所获得的新基因SEGX所编码的氨基酸经过空间折叠后可能与EGX 的功能相似，可能是 EGX 相关的新基因。为了进一步研究 SEGX 的作用及与
