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1、华中科技大学 硕士学位论文 磁性载体在固定化酶及连续式生物反应器中的应用研究 姓名：姜达海 申请学位级别：硕士 专业：生物医学工程 指导教师：赵元弟 2011-01-20 I 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 摘摘 要要 近些年来，各种有关磁性载体和固定化酶的研究均取得了较大的成果。Fe3O4 纳米颗粒因其优异的磁性能和良好的生物相容性成为学者们广泛研究的磁性载体 之一。磁性载体固定化酶即通过物理或者化学的方法将酶固定在磁性载体上，使其 既可以保持较高的酶活性又便于回收和重复利用。 介孔硅材料和磁性纳米颗粒的结合，即磁性介孔硅载体，可以通过对其表面改 性而
2、引入多种反应功能基团使其成为优良的载体。它既具有较大的比表面积可以负 载更多的目标分子或颗粒，同时也便于回收和重复利用。海藻酸钙凝胶颗粒与磁性 纳米颗粒结合，即磁性海藻酸钙凝胶微球载体，通过包埋法可以将生物大分子、酶 甚至完整的微生物包埋到凝胶微球中使其固定化，因为它不需要对酶进行化学修饰 且反应条件温和，很少改变酶的物理结构和化学性质，因而具有广泛的应用。 本文介绍了一种新型的磁性介孔硅固定化酶和磁性海藻酸钙凝胶微球固定化 酶的制备，最后对适用于磁性催化剂的生物反应器进行了研究。首先分别用微波法 和化学共沉淀法合成了 Fe3O4纳米颗粒，在比较优劣后分别用于制备磁性介孔硅载 体和磁性海藻酸钙
3、凝胶微球载体。利用 APTES 对磁性介孔硅载体表面进行修饰， 然后用偶联剂 PDC 将其与碱性蛋白酶偶联，酶活力实验结果表明其酶活回收率为 15.1%。对磁性海藻酸钙凝胶微球载体，在制备时直接将碱性蛋白酶包埋在其中， 酶活力实验结果表明其酶活回收率为 54 %。 最后设计了一种适用于磁性纳米催化剂 的生物反应器，该反应器具有提高催化剂的使用效率和减少污染的优点，且对不同 的工艺有较高的适应性，为磁性催化剂的连续使用提供了一条可行的路径。 关键词：关键词：磁性载体 介孔硅 海藻酸钙凝胶微球 固定化酶 连续式生物反应器 II 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文
4、 Abstract In recent years, Great progress has been made on magnetic particles as immobilized enzyme carrier. Due to unique superparamagnetic properties and biocompatibility, Fe3O4 nanoparticles has become one of the most popular magnetic carriers in biotechnology. Immobilization of enzyme on magneti
5、c carriers through physical or chemical methods has the advantage of both maintaining the high enzyme activity and facilitating recovery and recycling of enzyme in an easy and fast way. The combination of mesoporous silica materials and magnetic nanoparticles to form the magnetic mesoporous silica c
6、arrier (MMSC) could be a useful carrier due to the easily functionalized surface silanol groups and large surface area which can accommodate more target molecules. Most importantly, it can also facilitate the recovery and recycling of enzyme by applying an external magnetic field. The combination of
7、 calcium alginate gel sphere and magnetic nanoparticles to prepare magnetic calcium alginate gel (MCAG) is also studied in this paper. MCAG can embed biological macromolecules, such as enzymes or even a whole microorganism without need of chemical modification of enzymes and under mild conditions, t
8、hus rarely changes the physical, chemical and biological properties of enzymes. First magnetic nanoparticles were synthesized by co-precipitation and microwave method respectively. Magnetic nanoparticles synthesized by co-precipitation were used for MMSC preparation and that synthesized by microwave
9、 method were used for MCAG preparation. Then MMSC were modified by APTES to introduce amino groups and alkaline protease was immobilized using a coupling agent PDC. The enzyme activity results showed that the activity recovery rate was 15.1%. While the alkaline protease embedded in MCAG resulted the
10、 activity recovery rate about 54%. Finally, a high adaptable bioreactor using magnetic nano-catalysts for different processes was designed. The bioreactor has the advantages of improving the efficiency of mixing catalyst and recycling thus reducing pollution. This bioreactor provided a novel possibl
11、e way for continuous using the magnetic nano-catalysts. Key words: magnetic carrier mesoporous silica material calcium alginate gel sphere enzyme immobilization continuous bioreactor 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和 集体，
12、均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 保密， 在 年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于
13、 1 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1 绪绪 论论 近些年来随着纳米技术的迅速发展，纳米材料被广泛的应用于各个领域。磁性 纳米颗粒 （即一种尺寸分布在 1-100 nm 之间的由无机材料或者有机材料构成的磁性 颗粒）由于其独特的物理、化学及磁性性能，例如：高矫顽力、低居里温度、超顺 磁性等1-5，使之在磁流体、磁共振成像、环境修复、数据存储、催化剂等多个研究 领域引起了学者们极大的兴趣6-7。 尤其是在磁流体和数据存储方面的研究已经将磁 性纳米颗粒用于很多的商业应用。目前，磁性纳米颗粒也被用于生物应用，包括磁 分离、生物（细胞，蛋白质，核酸，酶，细菌，
14、病毒等）检测、临床诊断和治疗如 MRI （磁共振成像） 和 MFH （磁性流体热疗） 、 靶向药物运输和生物标记。 磁性 Fe3O4 纳米颗粒由于其良好的生物相容性、表面活性基团、生物可降解性及便于结合各种 功能分子（细胞、抗体、RNA 或者 DNA、酶等） ，引起了各界学者极大的关注8-10。 将 Fe3O4纳米颗粒用作固定化酶的载体，应解决如下问题：磁性 Fe3O4纳米颗 粒的粒径在纳米数量级，因此比表面积（表面积/体积）较大，具有较大的表面能， 颗粒之间就易团聚以增大自身的尺寸来减小比表面积，以此减小自身的表面能量， 使自身更加稳定；另外，赤裸的磁性 Fe3O4纳米颗粒的化学活性也很高，
15、这就使其 极易与空气发生反应，从而使其逐渐丧失可分散性和磁性。因此在实际应用中，需 要对磁性 Fe3O4纳米颗粒进行一定的表面修饰，以提高其化学稳定性。对磁性纳米 颗粒进行修饰不仅可以增强纳米颗粒的稳定性，也可以引入其他配体或基团，使其 在更大的范围内得到应用11-12。 磁性纳米颗粒经过修饰成为功能化的磁性纳米颗粒后在生物标记、催化和生物 分离等方面的应用非常广泛。尤其是在液相环境的催化反应中，这些用小的外磁场 可分离的磁性颗粒在同类的反应系统中有明显的优势，同时具有易分离、高分散性 和高活性等优点。以磁性纳米颗粒为核心制备的载体因其特殊的物理化学性质和独 特的优势引起了各个领域学者极大的关
16、注，随着制备技术的发展和研究的进一步深 化以磁性纳米颗粒为核心的载体技术的研究必将具备更加广阔的应用前景13。 2 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1.1 磁性纳米颗粒的性质磁性纳米颗粒的性质 小尺寸效应和表面效应是控制磁纳米颗粒性质的两个主要因素，它们使得磁纳 米颗粒具有了同其团块物质不同的特性，如图 1-114所示： 图1-1 不同磁性纳米颗粒中的不同的磁效应14。(a)铁磁体中电子的自旋产生磁场；(b)反磁体中 电子的自旋产生磁场；(c)不同磁极的组合曲线；(d)超顺磁性示意图；(e)铁磁体和反磁体发生表 面交互作用产生交换偏执作用；(f)纯反磁体纳米颗粒显示出超顺磁性消退和剩磁增加。 Figure 1-1 The different magnetic effects occurring in magnetic nanoparticles14. The spin arrangement in a) a ferromagnet (F
