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1、第七章 微生物的生长及其控制1 获得目标微生物的纯培养分离技术有哪些？ 答：1稀释法 （1）平皿倾注法 （2）平板涂布法 预先制备平板。然后制备并吸取适度稀释的菌液，滴于各平板中央（每皿一滴，约0.05ml），用无菌刮刀将菌液均匀涂布于平板表面。2平板划线法 划线的方式很多，其目的都是使平板上菌体逐渐变稀，最终形成单菌落。划线用平板也要预先制备。常用的是以下两种方式： （1）针尖稍弯的接种针火焰灭菌并冷却后，取样；在靠近平皿边缘处的平板上，将针尖的弯曲部位接触平板，接种棒与平板面成3040角，划3条4条平行线；转动平皿约50角，灼烧接种针，冷却后，通过前一区划2条3条平行线，并继续划2条3条不
2、通过前一区的平行线；再转动平皿如此划4区5区（图35A）。此种方法适用于分离纯化固体培养基上的培养物。 （2）灼烧并冷却的接种环取样后，在平板上作连续划线。此适用于液体样品。3单细胞挑取法 把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞吸取，再接种于培养基上培养。此法限于高度专业化的科研。4利用选择培养基分离法 （1）采用选择性高的培养基 例如，以纤维素为唯一碳源，分离分解纤维素的微生物；用无氮培养基分离自生固氮菌；在15ml培养基中加25乳酸1滴2滴以抑制细菌生长，把受细菌污染的霉菌分离出来。 （2）培养基中加抑制剂 例如，结晶紫10mg/L
3、可抑制G+细菌生长，利于分离G-细菌；KMnO4100mg/L抑制细菌和霉菌生长，利于分离放线菌；制霉菌素50mg/L或放线酮50mg/L利于分离纯化放线菌；分离纯化霉菌或放线菌时，加链霉素30mg/L、金霉素2mg/L可抑制细菌生长。5其他 如，高温处理（80 15min或100 10min）分离芽孢杆菌；4KOH处理痰液，分离结核杆菌等等。2 试分析影响微生物生长的主要因素及它们影响微生物生长繁殖的机制。 答：营养物质(营养物质不足导致微生物生长所需要的能量、碳源、氮源、无机盐等成分的不足，此时，机体一方面降低或停止细胞物质合成，一方面对细胞某些非必需或失效的成分进行降解以重新利用) 水（
4、对培养基的水活度有要求，每种微生物的生长都有最适的活度，会通过影响培养基的渗透压力变化而影响微生物的生长速率）温度（影响酶活性、影响细胞质膜的流动性、影响物质的溶解度）、PH（影响酶活性、通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率）氧（好氧菌20、微好氧菌210、耐氧厌氧菌2以下、兼性厌氧菌有氧或无氧、专性厌氧菌不需要氧，有氧时死亡）3 测定微生物群体生长有哪些方法？各有何特点和适用范围。答： 1）直接测量：a.测体积法：粗放型，在刻度离心管中测沉降量； B.称干重法：精确法，离心法和过滤法获得菌体细胞，微生物的干重一般为其湿重的
5、10%20% 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 2）间接测量：a.比浊法：用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用450650nm波段； B.生理指标法：微生物的生理指标，如氮、碳、DNA、ATP等物质的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。 常用于对微生物的快速鉴定与检测。4什么是抗生素？磺胺类药物的作用机理是什么？ （或：试述抗生素抑菌和杀菌机制及细菌耐药性机制。如何避免细菌耐药性的产生?） 1）抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质
6、。 2）细菌不能直接利用其生长环境中的叶酸，而是利用环境中的对氨苯甲酸(PABA)和二氢喋啶、谷氨酸在菌体内的二氢叶酸合成酶催化下合成二氢叶酸。二氢叶酸在二氢叶酸还原酶的作用下形成四氢叶酸，四氢叶酸作为一碳单位转移酶的辅酶，参与核酸前体物（嘌呤、嘧啶）的合成。而核酸是细菌生长繁殖所必须的成分。磺胺药的化学结构与PABA类似，能与PABA竞争二氢叶酸合成酶，影响了二氢叶酸的合成，因而使细菌生长和繁殖受到抑制。5常用的消毒灭菌的方法有那些？各种方法适用那些物品的灭菌？（或：下列物品各选用什么方法消毒或灭菌？说明理由。室内空气、培养基、玻璃器皿、酶溶液、动物血清） 答“(1)天然消毒法：利用日光等天
7、然条件杀灭致病微生物，达到消毒目的，称为天然消毒法。 日光曝晒法：日光由于其热、干燥和紫外线的作用，而具有一定的杀菌力。日光杀菌作用的大小受地区、季节、时间等因素影响，日光越强，照射时间越长，杀菌效果越好。日光中的紫外线由于通过大气层时，因散热和吸收而减弱，而且不能全部透过玻璃，因此，必须直接在阳光下曝晒，才能取得杀菌效力。日光曝晒法常用于书籍、床垫、被褥、毛毯及衣服等的消毒。曝晒时应经常将被晒物翻动，使物品各面都能与日光直接接触，一般在日光曝晒下46小时可达到消毒目的。 通风：通风虽然不能杀灭微生物，但可在短时间内使室内外空气交换，减少室内致病微生物。通风的方法有多种，如用门、窗或气窗换气，
8、也可用换气扇通风。居室内应定时通风换气，通风时间一般每次不少于30分钟。 (2)物理灭菌法：利用热力等物理作用，使微生物的蛋白质及酶变性凝固，以达到消毒、灭菌目的，称为物理灭菌法。 燃烧法：是一种简单易行、迅速彻底有效的灭菌方法，但对物品的破坏性大，多用于耐高热，或已带致病菌而又无保留价值的物品，如被某些细菌或病毒污染的纸张、敷料，搪瓷类物品如坐浴盆，也可以用火焰燃烧消毒灭菌，应先将盆洗净擦干，再倒人少许90酒精，点燃后慢慢转动浴盆，使其内面完全被火焰烧到。应用此法时，要注意安全，须远离易燃或易爆物品，以免引起火灾。 煮沸法：是一种经济方便的灭菌法，一般等水开后计时，煮沸1015分钟可杀死无芽
9、胞的细菌。可用于食具、毛巾、手绢等不怕湿而耐高温的物品的消毒灭菌。 高压蒸汽灭菌法：利用高压锅内的高压和高热释放的潜能进行灭菌，此法杀菌力强，是最有效的物理灭菌法。待高压锅上汽后，加阀再蒸15分钟，适合消毒棉花、敷料等物品。 (3)化学消毒灭菌法：化学消毒灭菌法是利用化学药物渗透细菌体内，破坏其生理功能，抑制细菌代谢生长，从而起到消毒的作用。家庭常用化学消毒灭菌方法有以下三种。 擦拭法：用化学药液擦拭被污染的物体表面，常用于地面、家具、陈列物品的消毒。如用05-3漂白粉澄清液、84消毒液等含氯消毒剂(现市场都出售，要看好有效期及使用方法)，擦拭墙壁、床、桌椅地面及厕所。 浸泡法：将被消毒物品浸
10、泡在消毒液中，常用于不能或不便蒸煮的生活用具。浸泡时间的长短因物品及溶液的性质而有不同。如用1-3漂白粉澄清液浸泡餐具、便器需1小时，用0.5“84”消毒液浸泡需15分钟，而用0.02高效消毒片浸泡只需5分钟，就可以达到目的。若浸泡呕吐物及排泄物，不但消毒液浓度要加倍，而且浸泡时间也要加倍。 熏蒸法：是利用消毒药品所产生的气体进行消毒。常用于传染病人居住过的房间空气及室内表面消毒。 福尔马林(甲醛)+高锰酸钾：每立方米加入福尔马林2540毫升，高锰酸钾1530克，两种药放置在一起即产生气体，可达到消毒目的。消毒时，必须将门窗紧闭12-24小时，消毒后再打开门窗进行通风，此法对各种细菌、病毒引起
11、的传染病均有效。 食醋：每立方米用3-10毫升食醋，加水23倍加热熏蒸，用于室内空气消毒，对于预防流感等呼吸道传染病有效。 6名词：灭菌、消毒、防腐、同步培养 灭菌：指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平 消毒：指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法 防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施 同步培养：指使细胞的分裂周期为同步的培养方法。第八章 微生物的遗传与变异1 试述历史上证明核酸是遗传物质的3个著名实验，为何均选择了微生物作为研究对象？答：所用的材料是细菌或病毒,遗传
12、物质都是裸露的,没有和蛋白质结合,这样就可以直接观察DNA的作用,而爱受蛋白质的影响。2抗药性突变是如何产生的？药物对抗药性突变体的产生起什么作用？ 答：抗药性突变和其他突变一样是不定向的基因突变.不是药物导致的（除非是引起突变的药物 达尔文四项中的过度繁殖就是指这个；提供大量可遗传变异（突变） 药物对抗药性突变体的产生起选择作用,就是“自然选择”3试述筛选营养缺陷型突变株的方法。 答：诱变 常用紫外线等物理方法和化学诱变剂等诱变形成大量营养缺陷型菌株.用15W或20W紫外灯管,距离15cm30cm,照射10sec20min.在照射受试菌前,灯管须预热20min,使灯光稳定.菌悬液要磁力搅拌,
13、使所有单细胞或单孢子均匀受到照射.特别要注意,应在黑暗或红外光下操作,接种后器皿用黑布包严,防止发生可见光的修复作用. 淘汰野生型 a）抗生素法 某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物,而对处于休止状态的微生物无杀伤作用.如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成,制霉菌素可损伤真菌细胞膜,二者可分别杀死生长繁殖着的细菌、真菌. b）菌丝过滤法 适用于放线菌、霉菌等丝状微生物.在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体,而营养缺陷型孢子则不生长.将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中,振荡培养10h12h,使原养型萌发（以肉眼刚能看见菌丝为度）,然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤,菌丝被滤除,未萌发
14、的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的. 检出缺陷型的常用方法 a）逐个测定法（点种法）把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落,表明其为营养缺陷型. b）夹层培养法经诱变处理后的菌液,稀释后与基本培养基混匀并倾入平皿中,待凝固后,再加上一薄层不含菌的基本培养基.培养后在皿底将长出的菌落做上标记.然后加上一层完全培养基,再经培养后,新出现的菌落多数是营养缺陷型。此法适用于兼性厌氧的细菌. c）影印法 将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上,固定
15、,作为影印接种工具,灭菌备用.将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上,培养,待长出菌落后,用影印接种工具在此平板上轻按一下,然后在另一基本培养基平板上按一下.经培养后在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落,为营养缺陷型. 鉴定营养缺陷型生长谱法 将检出的缺陷型菌株接种在完全培养基上培养,把生长的菌体或孢子洗下,离心清洗后制成浓度为107个ml108个ml的菌悬液.取0.1ml该悬液与基本培养基混匀倒皿,冷凝并稍干燥后,分区加沾有各种营养物的圆滤纸片,培养,观察生长反应.在筛选营养缺陷型的过程中必须注意表型延迟现象.由于诱变剂一般仅作用于DNA的某一单链,故突变无法反映在当代的表型上,需经DNA复制和细胞分裂后,才使表型发生变异,此即表型延迟现象。4. 比较转化、转导和接合的异同。 答：1）异：a.转化是细菌吸收外源DNA片段. b.转导是以噬菌体为载体来传递DNA c.接合则是两个细菌之间通过性菌毛直接交换DNA. 2）同：实现了外源
