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1、 学术论文题 目：抗体酶的研究与应用进展 类 别：综述型学 院：生物科学与工程学院专业班级：生物工程1102班学生姓名：闫超杰 （1112024045）刘青（1112024049） 陈建 （1112024053）周游（1112024050） 杨柚柳椰（1112024047）牛犇（1112024048） 2012年4月28号抗体酶的制备与应用研究进展闫超杰，刘青，陈建，周游，杨柚柳椰，牛犇 （陕西理工学院 生物科学与工程学院 生物工程专业 陕西 汉中 723000） 指导老师 陈琛内容摘要：抗体酶是具有催化性质的抗体，它同时具备抗体和酶的特征，可催化多种化学反应，如酰基转移、酯水解、酰胺水解、重
2、排反应、光诱导反应、氧化还原分应、金属螯合反应等。用人工方法合成的抗体酶，可作为研究酶作用机理的有力工具，用于催化大量天然酶不能催化的立体专一性反应，更为开发具有高度选择性的药物提供了新途径。本文对抗体酶的设计策略、制备方法、催化反应类型、及应用前景作了综述。关 键 词：抗体酶,过渡态类似物,应用 抗体酶（Abzyme）是一种新型人工酶制剂，它是依据对酶分子催化反应机制的理解，结合免疫球蛋白的分子识别特性，应用免疫学、细胞生物学、化学、分子生物学等技术制备的具有高度底物专一性及特殊催化活力的新型催化抗体并且具有典型的酶反应特性：与配体（底物）结合的专一性，包括立体专一性并且其催化反应的专一性可
3、以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速率比非催化反应快104108倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。如今由于抗体酶的多样性、特异性和稳定性，已经形成了生物界中一个崭新的超分子体系，它把免疫学、酶学理论的发展和抗体在医药、工业等领域的应用推向一个新水平。近些年来，其研究的技术日益先进，应用范围不断拓宽，越来越受科学家们的关注。1 抗体酶的制备1.1 抗体酶的设计策略 目前大多数抗体酶是通过以设计合理的，将反应过渡态类似的小分子作为半抗原，继而让动物免疫系统产生针对半抗原的抗体来获得的。最早的设计策略涉及运
4、用过渡态类似物制备抗体酶，随后，酶催化的化学本质如邻近反应、酸碱催化、共价催化等也用于抗体酶的设计。目前，抗体酶的设计策略有：稳定带电过渡态、诱导和转换设计、抗体作为熵阱效应、反应免疫、引入催化基因团。1.1.1稳定带电过渡态 以过渡态类似物作为半抗原，利用免疫系统的分子多样性，则有可能诱导产生对过渡态类似物特异性结合的抗体。这种抗体含有同底物反应过渡态互补的结合空腔，因而和酶一样，也能发生催化反应。1.1.2诱导和转换设计 诱导和转换设计的原理是利用半抗原和抗体间的电荷互补性，即以带电基团为“诱饵”，在抗体结合部位诱导带相反电荷的功能团，当底物不存在“诱饵”的电荷时，被诱导的功能团将以一般酸
5、碱或亲核催化对底物其它基团发生作用。1.1.3抗体作为熵阱效应 除稳定带电过渡态外，熵阱效应对催化反应也有决定性作用。熵阱是指催化剂以有利的定位方向结合底物的能力，因此限制了底物平动和旋转自由度，结果导致活性部位中底物的有效浓度增加。1.1.4反应免疫 通过使用一个能和抗体发生反应的化合物作为免疫原，促使抗体结合部位在免疫过程中发生特定的化学反应，诱导过程中抗体和抗原发生共价相互作用，产生的抗体同样也可能催化类似的反应。1.1.5引入催化基团 在抗体酶的结合部位引入催化基团，如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确，空间排布恰到好处，则应产生高活力抗体酶。引入催化基团的方法有：利用部位选择性试
6、剂，以类似亲和标记的方式定向的将催化基团引入抗体；用蛋白质工程技术引入带催化基团的氨基酸残基。1.2 抗体酶的制备方法 制备抗体酶的方法有很多，如诱导法、拷贝法、化学修饰法、引入辅助分子法、天然来源抗体酶、基因工程法等。酶的基本概念如张力 、邻近效应、酸碱催化和共价催化等被用于抗体酶的设计。1.2.1诱导法 即单克隆技术也称为杂交瘤技术或体内免疫法来制备。因为过渡态极不稳定，是一种稍纵即逝的结构，其寿命约为 s,因此不可能用它对动物进行免疫。用一个或其它几个原子或原子团取代过渡态的特定原子或原子团获得在形状、电性、酸碱性等诸方面与过渡态相似的稳定物质，即过渡态相似物，然后用它作为半抗原和载体蛋
7、白一起对动物进行免疫，最后取免疫动物的脾细胞与骨髓肿瘤细胞进行杂交，其杂交细胞就会源源不断地分泌单克隆抗体，进过筛选和纯化，可得抗体酶。在抗体酶的制备中，由于大多数反应过渡态类似物的分子质量都较低，即所谓的半抗原，它们本身的免疫原性很弱，必须与某种载体偶联才能表现免疫原性，最常见的载体蛋白包括牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA）和钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin, KLH）。而抗体酶单克隆的方法也不断发展。现有酶联免疫吸附法（ELISA)、竞争性酶联免疫吸附法（competivc ELISA)、催化酶联免疫吸附法（catELISA）以
8、及用短过渡态类似物片段进行筛选等多种方法。国内邓超用meso四（a，a，a，a0苯乙酰苯）卟啉为抗原，通过动物免疫、细胞融合等技术筛选细胞株3E4。该细胞株产生的抗体具有结合铁卟啉的能力，且表现出过氧化物酶活力。 1.2.2拷贝法 用已知的酶作为抗原免疫动物，通过单克隆技术，制得抗该种酶的抗体，再以此种抗体免疫动物，再次采用单克隆技术，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活性的抗体。因为抗原与该抗原产生的抗体具有互补性，经过上述两次拷贝，就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上，使该抗体酶能高选择性地催化原酶所催化的反应。这种方法虽然不能产生新的催化反应，但对自然界来源稀少的紧缺酶，不失为一种有效的方
9、法。1.2.3化学修饰法 抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法的方法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法，在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。游离巯基就是适合的基团之一，具有高亲和性、易于氧化及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。1.2.4引入辅助因子法 很多天然酶活性中心都含有金属离子。将引入某辅助因子的半抗原通过共价键连接在载体蛋上免疫后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅助因子的参与下，这些抗体酶能选择性地对肽键进行水解。1.2.5天然来源抗体酶 在全身红斑狼疮病人的血清中已分离出抗体酶，它具有催化水解DNA的活性。表明在有免疫性缺陷的病人体内存
10、在着抗体酶。1.2.6基因工程法-噬菌体展示技术 通过基因工程、蛋白质工程将编码的人工合成的基因转入细菌或酵母菌的表达系统，采用突变等手段随机产生抗体，经筛选和纯化可得抗体酶。随着DNA重组技术的进展和人们对抗体分子认识的深化，抗体技术由细胞工程抗体（杂交瘤单克隆抗体）发展到基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，将抗体工程推进到了一个新的发展阶段。随后在噬菌体抗体库技术的基础上，人们又发展了噬菌体演示技术。这种技术将组建亿万种不同特异性抗体可变区基因库和抗体在大肠埃希菌功能性表达与高效快速的筛选手段结合起来，彻底改变了抗体酶制备的传统途径，使抗体酶的制备和性能改良进入了新的阶段。噬菌体演
11、示技术不需要进行细胞融合以获得杂交瘤细胞，并且可筛选具有特定功能的未知结构，具有生产简单、价格低、降低抗体的免疫原性、易获得稀有抗体的优点，因而显示出有取代杂交瘤技术的趋势。2 抗体酶的催化反应类型 抗体酶具有典型的酶反应特征：与配体结合的专一性（包括立体专一性），可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效性，比非催化反应快倍，有些已经接近天然酶反应速度；具有与天然酶相近的米氏动力学及pH依赖性等。由于抗体酶是人工设计的酶，理论上其催化范围可以十分广泛，随着半抗原设计和抗体酶筛选技术的不断发展，其品种还在不断增加。催化的反应类型也在扩大，其中有些反应没有天然的酶可以催化，抗体酶甚至可以使热力学上
12、无法进行的反应得以进行。抗体酶催化的反应类型包括酯水解、酰胺水解、酰基转移、光诱导反应、氧化还原反应、Claisen重排反应、金属螯合反应等。2.1 磷酸酯水解反应 磷酸二酯键是自然界最稳定的键之一，因此它的水解对抗体酶来说是个主要的挑战。Janda等利用稳定的五配位氧代铼（V）配合物A模拟RNA水解时形成的环形氧代正膦中间物，产生单抗2G12，可以催化水解磷酸二酯。催化速率常数=1.53，米氏常数=240 umol/L ；/=312。2.2 磺酸酯闭环反应 Lerner小组用脒基离子化合物（一种阳离子过渡态类似物）作为半抗原，产生的抗体（17G8）可以催化芳基磺酸酯B的闭合反应，使B转化为C
13、(1,6- 二甲基环己烯）和D（2-甲烯-1-甲基环己烷）的混合物。2.3 酰基转移反应生物体内蛋白质合成是一个复杂的过程。氨基酸在掺入肽链之前 必须进行活化以获得额外能量，活化过程即酰基转移反应，又称酰基化反应。1986年，Tramonatano 等成功研制首列酰基转移抗体酶。Jacolson等设计了一个中性磷酸二酯作为反应过渡态的稳定类似物，得到的单克隆抗体可以催化带丙氨酸的胸腺嘧啶的氨酰化反应反应速率比无催化反应的速度提高了倍。2.4 重排反应Claisen重排反应是有机化合物异构化的一种重要形式，分枝酸盐转化为预苯酸盐的反应是细菌、真菌、植物体内芳香氨基酸生物合成的关键一步。Hilve
14、rt等设计了一个椅式构象的氧杂双环化合物作为反应的过渡态类似物，制备出了可催化分枝酸生成预苯酸这样一个Clasien重排反应的酶，诱导的抗体酶比原反应速度加快倍。而且还观察到新抗体酶表现出了高度的立体专一性，它只催化（-）分枝酸为底物的反应，对（+)公枝酸无作用。2.5 氧化-还原反应氧化还原反应在生物体内十分广泛，如呼吸链上的系列反应。Shokat制得了对氧化态=8 mmol/L，对还原态=300 nmol/L的抗体，使标准电位变为340 mV。由于黄素还原态的还原范围扩大，使一些原来无法按其还原的物质（标准还原电位差大于无抗体酶催化的黄素标准还原电位差）得以还原。这意味着抗体酶可以使热力学
15、上原来无法进行的氧化还原反应得以进行。2.6 金属螯合反应金属螯合反应对于辅酶、辅因子和酶的结合来说意义重大。P.G.Schultz等用G-甲基卟啉诱导产生的抗体可催化平面状卟啉的金属螯合反应，该抗体不仅可催化和卟啉的螯合，还可催化和卟啉的螯合。实验表明，抗体酶对其中某些金属卟啉具有很高的亲合力，意味着可以研制抗体血红素复合物为催化剂催化氧还反应，电子传递反应等。2.7 光诱导反应光诱导反应包括光聚合反应和光裂解反应。这两类反应在植物体内显得尤为重要。DNA的修复也涉及到光诱导反应，Cochran对胸腺嘧啶二聚体光解进行研究，发现天然光复活酶的活性中心是色氨酸，由此找到相应的抗体酶IgG15F1-3B1，此抗体的转换数（T.N.）和光复活酶相近。Balan研究了光聚合反应的抗体酶，通过诱导法，得到的抗体酶催化效率虽不高，但也使反应速度提高了2.5倍。3 抗体酶的利用价值 从抗体酶的实践看出，抗体酶是研究酶作用机理的有力工具。酶抑制剂的研究支持了Pauling过渡态理论，但它只能提供作用过程中结合专一性的信息，不能给出结合后发生催化反应以及结合与催化之间的关系。抗体酶实验则弥补了这一缺陷。 除了基础理论研究的价值，抗体酶的应用前景也令人鼓舞。
