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1、南方医科大学2 0 0 8 级硕士学位论文 硫酸软骨素酶A B C 对体外胶质瘢痕模型治疗作用的初步实验研究 E f f e c to fC h A B Co ng l i a ls c a r ：ap r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t ss t u d y nv i t r o 课题来源：广东省及广州市科技计划项卧粤财教( 2 0 0 8 ) 2 5 8 2 0 0 8 A 0 3 0 2 0 1 0 1 9 ，粤科基办 ( 2 0 0 7 ) 0 5 0 6 7 0 0 5 2 0 6 ；穗科技条字( 2 0 0 8 ) 3 - 2 0 0 8
2、A ! E 4 0 11 - 6 ，0 9 8 5 2 1 2 0 11 2 2 0 0 9 J 1 C 4 1 8 2 】 专业名称神经外科学 学位申请人李业海 指导教师姜晓丹教授 答辩委员会主席 答辩委员会成员 陈善成教授 陆永建教授 梁军潮教授 张旺明教授 汪求精教授 论文评阅人陈善成教授 张旺明教授 2 0 11 年0 3 月3 0 日 1 1 1 1 1 1111111 1 1 1 1 1 11 1 1 11 1 1 1 1 1 11 1111111 11 1 1 1 Y 19 9 7 4 8 1 硫酸软骨素酶A B C 对体外胶质瘢痕模型治 疗作用的初步实验研究 硕士研究生：李业海
3、 指导教师：姜晓丹教授 摘要 研究背景 中枢神经系统( C e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，C N S ) 是人体神经系统的最主体部 分，包括脑和脊髓，其主要功能是传递、储存和加工信息，产生各种心理活动， 支配与控制人的全部行为。C N S 损伤后，由于病变的神经细胞不能有效地进行再 生修复，而使其成为致死率、致残率高居榜首的疾病之一。因此，C N S 损伤的治疗 是医学界的难点，也一直是国内外研究热点。 C N S 损伤后，有多种抑制因素阻碍了轴突的再生，最终导致轴突再生失败 或局部仅形成有限的生长。在损伤点周围形成胶质瘢痕，是C N S 对损伤的一
4、个 重要的反应，并成为抑制轴突再生的一个重要抑制因素。瘢痕组织是由活化的 星形胶细胞、少突胶质细胞前体细胞、激活的小胶质细胞巨噬细胞、脑膜成纤 维细胞和血管内皮细胞等组成；在胶质瘢痕中包含了多种抑制轴突再生的抑制 性分子，其中最重要的一种抑制分子是硫酸软骨素蛋白多糖( C h o n d r o i t i ns u l p h a t e p r o t e o g l y c a n s ，C S P G s ) 。有研究认为，在C N S 损伤后，有多种类型的C S P G 表 达迅速提高，其不利于损伤的修复，导致神经轴突再生失败。还有研究表明， C S P G s 发挥抑制轴突再生的结
5、构是其氨基葡聚糖侧链，通过硫酸软骨素酶A B C ( C h o n d r o i t i n a s eA B C ) 消化其侧链，具有减轻抑制轴突再生的能力。在C h A B C 用于治疗C N S 损伤的体内研究中，发现了C h A B C 具有使部分神经纤维再生、 提高神经的塑性和促进神经恢复的作用。但是到目前为止，C h A B C 的去胶质瘢 中文摘要 痕的机制还并不完全清楚，其发挥作用的最佳条件亦无统一答案。 为了从去胶质瘢痕的角度促C N S 损伤后的神经再生，本研究通过用不同浓 度的C h A B C 对体外胶质瘢痕模型治疗作用的初步探讨，为后续深入研究在体 C N S 受
6、损后的神经再生提供去胶质瘢痕方面的前期工作基础。 第部分皮层星形皎质细胞、脑膜成纤维细胞的原代培养纯化及鉴定 目的：获取、传代培养及初步鉴定大鼠皮层星形胶质细胞和脑膜成纤维细 胞，为下一步建立体外胶质瘢痕模型及其治疗研究奠定基础。 方法： 1 星形胶质细胞的原代培养、纯化、传代及成熟化培养。 1 1 混合胶质细胞原代培养：取新生l 3 天W i s t a r 大鼠2 只，7 5 酒精浸 泡3 5 分钟，断头处死，完整取下大脑，D H a n k s 液冲洗3 遍；分离大脑皮层， 用显微镊仔细剥离脑膜和血管，再以D H a n k s 液冲洗3 遍；置青霉素小瓶中剪 成 4 周后，得到了高分化
7、星形 胶质细胞；脑膜成纤维细胞体外增殖快，纯度高，活力好。可以用于后续实验。 第二部分胶质瘢痕体外模型的制作及鉴定 目的：探讨体外胶质瘢痕的制作方法，为下一步的治疗研究奠定基础。 方法：实验分为四个组，( 1 ) 正常星形胶质细胞对照组( A C t r l ) ；( 2 ) 星 形胶质细胞机械划伤组( A S c r ) ( 3 ) 星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养组 ( A + F ) ；( 4 ) 星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养结合机械划伤组( A + F S e r ) 。 通过对星形胶质细胞进行机械划伤和脑膜成纤维细胞两种刺激，来模拟C N S 损 伤后的胶质反应；并通过观察各
8、实验组星形胶质细胞在形态学，G F A P 、C S P G s 蛋白表达上的变化，进而确定体外胶质瘢痕的制作方法。 1 星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养：星形胶质细胞经体外培养分化成 熟后，以血细胞计数板计数，调整细胞浓度为2 0 1 0 5 个m l ，每孔4 O 1 0 5 个 星形胶质细胞，接种于P D L 包被的1 2 孔细胞培养板，置于3 7 0 C 、5 C 0 2 培养 箱中培养，每周换液3 次，培养5 7 天，待细胞胞突连接成网络状，即取脑膜 成纤维细胞用于共培养，每孔接种5 0 X1 0 4 个脑膜成纤维细胞，置于3 7 0 C 、 2 d ，3 d 并进行 形态学、免疫
9、荧光学观察，星形胶质细胞以G F A F ( 红色荧光) 标记，脑膜成纤维 细胞以F i b r o n e c t i n ( 绿色荧光) 标记。 2 机械划伤：待星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养2 天后，在超净工作 台内，用1 0 此的微量移液器塑料吸嘴，在1 2 孔板内进行“稃”字样划伤，使损 伤程度和范围基本保持一致。损伤后，D H a n k s 液冲洗三遍，然后加入完全培 养基，置C 0 2 孵箱继续培养。分别于损伤后0 、2 4h 观察细胞生长情况及免疫 荧光鉴定。 3 结果分析 对各实验组的胶质瘢痕模型标志物G F A P 、C S P G s 的特异性表达，进行免疫 荧光染
10、色。免疫荧光染色图片，则用I P P 免疫荧光强度分析法进行评估，免疫荧 光强度用平均光密度值表示，并进行各组G F A P 、C S P G s 免疫荧光强度的统计学 分析。 结果 1 星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养结果：本实验比较了正常星形胶 质细胞和星形胶质细胞与脑膜成纤维细胞共培养l 天、2 天、3 天的模型。发现 脑膜成纤维细胞具有明显的促进星形胶质细胞活化和G F A P 的表达作用。A C t r o l 组，星形胶质细胞分化成熟、胞突丰富，免疫荧光显示：G F A P 主要表达在核周 围的细胞骨架上；A + F 组共培养1 天后，星形胶质细胞增长的胞突向脑膜成纤 维细胞生长
11、，并将其包围，且与脑膜成纤维细胞接触的胞突，G F A P 染色荧光更 明亮；共培养2 天后，脑膜成纤维细胞周围形成星形胶质细胞活化点，G F A P 染 色呈强阳性；共培养3 天后，活化点更明显，大量的星形胶质细胞聚集到脑膜 细胞周围，伸长的胞突长入脑膜成纤维细胞集落区，与脑膜成纤维细胞紧密地 长在一起，形成瘢痕样结构，G F A P 染色呈强阳性。 2 机械划伤后，A S c r 组、A + F S c r 组星形胶质细胞胞突迅速向划痕中央生 长，4 小时即可观察到胞突生长；2 4 小时后划痕两侧的星形胶质细胞胞突有少 V 中文摘要 部分接触，且在划痕中央可以见到迁移的星形胶质细胞；免疫荧
12、光染色显示： 划痕两侧星形胶质细胞的胞突粗大、G F A P 表达增强，在A + F S c r 组划痕处的星 形胶质细胞G F A P 表达亦强于远离划痕处的星形胶质细胞。 3 胶质瘢痕模型鉴定结果： A C t r ! 组：G F A P 荧光染色均匀但较弱，平均光密度值为O 1 7 4 6 0 ：0 0 0 3 9 ； C S P G s 荧光微弱，平均光密度值为0 0 0 7 5 4 - 0 0 0 0 7 。 A S c r 组：划痕边缘星形胶质细胞G F A P 荧光明显增强，平均光密度值为 0 2 5 5 4 4 - 0 0 0 6 1 ；C S P G s 主要表达于划痕边缘，
13、荧光也较对照组增强，平均光密 度值为0 0 111 + 0 0 0 0 7 ； A + F 组：G F A P 的荧光强度和A S c r 组相似，但分布较均匀，在与脑膜成 纤维细胞交界处，G F A P 荧光更强，平均光密度值为0 4 6 4 5 + 0 0 0 4 9 ；C S P G s 的 荧光强度也明显较正常星形胶质组和正常星形胶质细胞划伤组的强，主要分布 于星形胶质细胞胞体上，胞核未见荧光染色，平均光密度值为0 0 3 9 8 4 0 0 0 0 8 。 A + F S c r 组：具有A S c r 组和A + F 组共有的特征，其G F A P 平均光密度值 为O 5 0 4
14、2 4 0 0 0 5 1 ，C S P G s 平均光密度值为0 0 4 1 0 4 0 0 0 0 6 。 统计分析显示各胶质瘢痕模型组间G F A P 的荧光强度差异有统计学意义 ( F - - 1 5 0 2 0 3 4 5 ，P O 0 5 ) ，时间水平和细胞水平不存在交互效应( F = O 2 9 9 ，P 0 0 5 ) ( 表1 2 ) 。 第一部分皮层星形胶质细胞、脑膜成纤维细胞的原代培养、纯化及鉴定 表1 2C C K 8 法检测小细胞的增殖活力( O D 4 5 0 I l m ，i 士S D ，n _ 3 ) T a b l e1 2A s s a yo nt h e
15、m i c r o g l i ap r o l i f e r a t i o nb yC C K 8K i t ( O D 4 5 0 n m ，X 士S D ，n = 3 ) 宰主效应的，统计量和尸值；# 交互效应的，统计量和尸值。 ( 七) 、流式细胞仪鉴定并检测小胶质细胞免疫表型( 图1 9 ) 流式细胞仪检测结果显示，Y i e l dl 与Y i e l d3 小胶质细胞C D ll b c 、C D 4 5 表达阳性，且阳性率达9 5 以上；抗原提呈细胞表面标记物C D 8 0 、C D 8 6 低表 达，e l d1 与Y i e l d3 小胶质细胞C D 8 6 阳性表达
16、率呈现一定差别；但G F A P 抗 原小胶质细胞无表达。 ( 八) 、扫描电镜观察小胶质细胞的超微结构( 图1 1 0 ) 扫描电镜显示，体外培养1d 后Y i e l dl 、Y i e l d2 、Y i e l d3 小胶质细胞形态 上没有明显差别，均呈胞体饱满、胞突细长等细胞形貌特点。 ( 九) 、小胶质细胞吞噬功能的分析( 图1 1 表1 3 ) L P S 组的y i e l d1 、y i e l d3 小胶质细胞突起由短长形转向扁平、圆形，而且 L P S 组y i e l dl 小胶质细胞吞噬乳球微粒的速度明显快于正常组，差异有统计学 意义( S E = O 4 5 7 ，n = 2 0 ，产- 2 2 0 8 2 ，P = O 0 0 0 ) ；L P S 组y i e l d3 小胶质细胞吞噬 硕士学位论文 乳球微粒的速度也明显快于正常组，差异有统计学意义( S E = 0 4 5 2 ，
