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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：垒查迸日期： o l o f 2 - 妒 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规忌即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位
2、属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 上0 1 0 C ) V二 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要5 二、英文缩略语1 1 三、论文 第一部分1 2 前言1 2日U 舌l Z 材料和方法1 2 结果1 4 讨论1 9 结论2 0 第二部分：2 2 前。言2
3、2日U 舌Z Z 材料和方法2 3 结果2 5 讨论3 3 结论3 6 四、本研究创新性的自我评价3 8 五、参考文献：3 9 六、附录 综述4 4 在学期间科研成绩5 6 致谢5 7 个人简介5 8 中文论著摘要 直肠癌磁共振B O L D 成像及其与肿瘤血管生成 及侵袭性的相关性研究 目的 结直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤死亡原因的第二位，近年来 发病率呈明显上升趋势。常规M R 扫描具有良好的软组织分辨率，能多方位、多 平面成像，可以较好的显示直肠癌的肿瘤形态，可以判断对直肠周围的侵犯情况 及有否转移，但不能评价器官功能的改变以及病灶内氧代谢水平的情况。磁共振 血氧水平依赖成像
4、( B O L D ) 成像的作用不同于常规M R 扫描，通过T 2 牛和R 2 宰 的变化，可以对病灶的氧代谢情况做出定量、半定量的分析，由此反映肿瘤的氧 代谢水平，帮助判断放化疗敏感性，从病变形态学的观察过度到微观的代谢和功 能状态分析，在病变的诊断、临床分期及疗效的预测和评价方面均可发挥作用。 随着M R 技术的发展，使得B O L D 成像更快捷，时间分辨率更高，B O L D 成像技 术已广泛应用于头部，在腹部多用于肾脏，本研究在国内初次将其应用于直肠癌。 恶性肿瘤的生长、转移和播散离不开自身血供的建立，这个过程的建立与微 血管密度增加有关，侵袭、转移是恶性肿瘤最重要也是最本质的生物
5、学特征，是 恶性肿瘤患者死亡的主要原因，直肠癌也不例外，基质金属蛋白酶2 ( m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s 2 ，M M P 2 ) 可通过对细胞外基质降解，促进癌细胞对周围组 织浸润和转移的发生，在肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用。本实验就结直肠癌 B O L DM 成像参数R 2 * 与M M P 2 和M V D 计数相互间的相关性进行研究，从而为 应用B O L D 成像预测直肠癌血管生成及其侵袭转移能力提供依据。 材料与方法 1 、临床资料 2 0 0 9 年6 月2 0 0 9 年1 2 月在中国医科大学附属第一医院就
6、诊，临床诊断直肠癌 的6 3 例患者行磁共振平扫及B O L D 成像。术前患者均未进行放化疗，在检查后2 周 内经手术证实为直肠腺癌，将获取了肿瘤大体标本及完整病理报告的5 1 例纳入本 研究。男性2 9 例，女性2 2 例。年龄3 5 “ 8 3 岁，平均6 0 7 士1 0 4 岁。肿瘤位于直肠上 段1 2 例，直肠中段2 3 例、直肠下段1 6 例。5 1 例直肠腺癌中高分化1 2 例，中分化3 1 例，低分化8 例。临床病理分期采用D u k e s 分期法，标准为：A 期：癌肿侵犯粘膜 或粘膜下层、浅肌层、深肌层；B 期：侵犯直肠壁外；C 期：淋巴结转移；D 期： 远处转移或腹膜转
7、移。本组5 1 例中A 期6 例，B 期1 5 例，C 期2 3 例，D 期7 例。 2 、B O L D 成像扫描方法、图像后处理及分析 ( 1 ) B O L D 成像扫描方法 检查前6 小时禁食，确保肠道清洁。检查前4 0 m i n 口服盐酸消旋山莨菪碱 ( R a c e a n i s o d a m i n eH y d r o c h l o r i d e 蛳e c t i o n ，10 m g m l ，山西双鹤药业) 2 0 m g ，部 分充盈膀胱。扫描时自由呼吸，无需屏气。所用机型为G ES i g n a H D x3 0 T 磁共振 扫描仪，8 通道相控阵列表面
8、线圈。 患者仰卧于检查床上，直肠内灌注温水2 0 0 “ - - 6 0 0 m l ( 视患者耐受情况而定) ， 先行盆部M R 平扫，包括轴位、冠状位及矢状位T 2 W I 及轴位T 1 M 。平扫后，选 择病变最大层面做靶层面进行B O L D 轴位及冠状位或矢状位扫描，各扫描两层， 得到4 8 幅图像。具体扫描参数见表1 。 表1 ，T 2 W I 、T 1 W I 及B O L D 具体扫描技术参数名称 ( 2 ) 后处理及分析 将B O L D 图像传送到G E 公司的A W 4 4 图像后处理工作站，采用预装的 R 2 S T A R 软件自动生成B O L D 图像，首先评价B
9、 O L D 图像质量级别，以周围脂肪 信号强度作为背景噪声，计算图像的信噪比，并对B O L D 图像获得病灶的R 2 * 值， 计算观察者问及观察者内差异。R O I 区域要选择明确的病灶实性部分，多点采集 2 3 、病理标本处理及免疫组织化学方法 病理学切片制备、染色及读片结果均在病理科老师指导下完成。 ( 1 ) 切片制作 对所选病例的石蜡包埋组织行连续切片，切片厚4 p , m ，连续切片4 张，第一 张切片行H E 染色，其余3 张用于免疫组化染色。 ( 2 ) 免疫组织化学实验方法 免疫组织化学方法采用过氧化物酶标记的链霉素卵白素法( S P ) 染色。C D 3 4 、 M M
10、 P 2 单克隆抗体及S P 免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 已知的阳性直肠癌切片作为阳性对照，阴性对照用P B S 缓冲液代替一抗染色。 ( 3 ) 免疫组织化学结果判断 微血管密度( m i c r o v a s c u l a rd e n s i t y ，M V D ) 计数：M V D 定义为单位面积组 织切片内C D 3 4 染色阳性的微血管细胞数。肿瘤内孤立的棕黄色血管内皮细胞或 细胞簇代表1 条单独的微血管。先在低倍镜下( 1 0 0 x ) 浏览全片，找出微血管密 度大的“热点”( h o ts p o t ) ，换高倍镜( 2 0 0 x ) ，每张
11、切片记录5 个“热点”，取其平 均数作为该病例的M V D 。 M M P 2 判定标准：阳性主要表现为显微镜下肿瘤细胞胞质、血管内皮、间质 中出现棕、黄色颗粒或团块。判定标准：先用低倍镜( 4 0 x ) 全面观察切面，选定 待测组织M M P 2 染色最强处，然后在2 0 0 倍镜下计数1 0 0 个细胞，阳性染色细胞 5 0 为强 阳性( 十H ) 。 4 、统计学处理 所有数据用S P S S1 3 0 及M e d c a l c 统计学软件包及分析处理。计量资料以均数士 标准差表示。对于正态分布、方差齐性的计量资料，两组间比较采用t 检验法或配 对t 检验法，多组间比较采用单因素方
12、差分析的方法。对于偏态分布的计量资料或 等级资料，采用非参数检验。参数间相关分析采m P e a r s o n 法或S p e a x m a n 秩相关分 析。以P 0 0 5 ) 。D u k e s 分期各组 R 2 木值随期别增加呈增大趋势，经统计分析，A 期与其他期别R 2 * 比较差异有统计 学意义( P 0 0 5 1 6 7 O 0 5 A 期与其他期间 2 1 6P 0 0 5- I 7V V 一 2 5 1 1 ：5 1 2 9 3 1 ：5 7 P o 0 5 ) 。 附图 图1 直肠癌大体标本 图2 正常直肠粘膜H E 染色( 1 0 0 )图3 直肠癌H E 染色(
13、 X1 0 0 ) 图4 正常直肠组织C D 3 4 染色( x 2 0 0 )图5 直肠癌C D 3 4 染色( x 2 0 0 ) 图6 正常直肠组织M M P 2 染色( x 2 0 0 ) 图7 直肠癌M M P 2 染色( x 2 0 0 ) 病例1 男，4 9 ，高分化腺癌，D u k e s C 期。图 B O L DM R I ；图 H E 染色；图 M V D 计数( 较低) ，图M M P 2 染色( 阳性) M V D ( 较高) ；图M M P - 2 染色( 强阳性) 。 图 图M v D ( 较高) ：图舢- 2 染色( 阳性) 讨论 l 、直肠癌M V D 计数及
14、M M P 2 表达分析 直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一。大量研究表明，肿瘤血管生成是肿瘤发生 发展过程中的一个必要的具有关键意义的步骤，新生血管生成是实体瘤生长和恶 性进展的基础。微血管密度( m i c r o v e s s e ld e n s i t y ，M V D ) 是反映肿瘤血管生成一个 重要参数。采用对血管内皮细胞抗原的免疫组织化学技术染色进行微血管定量的 方法( M V D ) ，能准确可靠反映肿瘤血管生成，是预测肿瘤侵袭转移、复发和预后 的一项重要指标，并已在大多数肿瘤中获得证实。在内皮细胞标记物中，抗人原 始造血细胞抗原( C D 3 4 ) 单克隆抗体对淋巴细胞和基质细胞不存在任何交叉反应， 敏感性和特异性高，微血管染色定位更准确。本研究采用C D 3 4 单克隆抗体对内 皮细胞进行标记，癌组织中微血管呈棕褐色染色，清楚可辨，与切片背景对比良 好，能够保证准确进行M V D 计数。T a k e b a y a s h i 等【3 3 】研究结直肠癌时发现肿瘤的 M V D 与肿瘤的D u k e s 分期、浸润深度以及淋巴结转移均有明显相关性，C h a n g 1 3 4 等的研究也认为，直肠癌的淋巴结及远隔转移与M V D 计数呈正相关。而B o s s i t 3 5 】 等 和C h e n l 3 6 】等报道结直肠癌的M V D 与
