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1、苏州大学 硕士学位论文 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌SGC-7901细胞株增殖抑制作 用的体外研究 姓名：邢士超 申请学位级别：硕士 专业：肿瘤学 指导教师：沈丽琴;庄志祥 20090401 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究中文摘要 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株 增殖抑制作用的体外研究 中文摘要 研究背景：化疗在胃癌的治疗中占有重要的位置。多项临床研究证实， 化疗与最好的支持治疗相比，可延长晚期胃癌患者的无进展生存期( P F S ) 和总生存时间( O S ) 。奥沙利铂( O X A ) 是继顺铂(
2、 D D P ) 和卡铂( C B P ) 之后的第三代铂类广谱抗癌药，己在消化道肿瘤( 如结肠癌、胃癌等) 化疗中占有重要地位。但其周围神经系统毒性为剂量限制性毒性，如何 有效降低O X A 急性神经毒性的发生率和严重程度有着重要的临床意义。 大量临床试验证实硫酸镁能有效减轻O X A 所致的神经毒性，但是目前尚 无足够的临床证据及体外试验能够证实硫酸镁对O X A 的药效影响，因此 我们对硫酸镁对O A X 的药效影响进行了体外研究。本实验主要观察硫酸 镁与奥沙利铂联合对人胃癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用，从而进一步 探讨其与化疗药物联合在抗肿瘤作用中的疗效和可能的作用机
3、制。 研究方法：( 1 ) 应用M T T 法检测不同浓度组硫酸镁与奥沙利铂联合对 人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖的影响。( 2 ) 应用流式细胞术A n n e x i n V E G F P P I 双标法分析对照组及各药物处理组诱导人胃癌S G C 7 9 01 细胞 株凋亡作用。 实验结果：( 1 ) 硫酸镁和奥沙利铂联合能够增强奥沙利铂对人胃腺癌 S G C 7 9 0 1 细胞株增值抑制作用，而且随着硫酸镁浓度的增高，对人胃腺 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究中文摘要 癌S G C 7 9 0 1 细胞株增值抑制
4、作用增强。但硫酸镁0 4 0 m g m l 对增强奥沙利 铂对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增值抑制作用不明显。( 2 ) 应用流式细胞 术A n n e x i nV E G F P P I 双标法检测结果：O X A 与高浓度硫酸镁( 1O 0 0 m g m 1 ) 凋亡率( 5 5 9 0 ) 最高，在与O X A 组、高浓度硫酸镁组、低浓度硫酸镁 组( O 4 0 m g m 1 ) 、O X A 与低浓度硫酸镁组凋亡率组进行两两比较时，差异 有显著性( P 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺痛S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究前言 上- J 刖吾 据P
5、 a r k i n 等最新报道，全世界2 0 0 2 年新诊断恶性肿瘤病例数为10 9 0 万，因癌症死亡病例数为6 7 0 万。现癌症患者24 6 0 万。其中胃癌新发病 例数为9 3 4 万，其排位由原来的第二位降到了第四位，而死亡病例数为 7 0 万，仍仅次于肺癌占第二位。 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。近3 0 年来，我国城市居民胃癌 发病率在男女性中都呈下降趋势，但据卫生部信息统计中心2 0 0 1 年的资 料显示，全国城市居民恶性肿瘤死因顺序中胃癌仍占第3 位。胃癌仍是 严重威胁人民健康的疾病。 迄今为止，胃癌的治疗仍以手术为主，但化疗在胃癌的治疗中占有 重要的位置。多项临床研
6、究证实，化疗与最好的支持治疗相比，可延长 晚期胃癌患者的无进展生存期和总生存时间。晚期胃癌的化疗至今仍然 未能确定标准化疗方案，F U P 、E C F 、L V 5 F u 2 等方案目前在临床被广泛 采用。 铂类药是胃癌化疗主要药物，D D P 与O X A 是最常用铂类药。以铂类 为基础联合5 F u 类组成二联方案或以F P 为基础加第三药构成三联方案者 占到铂类联合方案的9 7 。可以认为5 F U 类与铂类治疗晚期胃癌( A G C ) 是目前最常用方案。 O X A 联合5 F u 的F O L F O X 一线治疗A G CI I 期临床试验结果显示O X A 治疗A G C
7、疗效显著。从2 0 01 “ 一2 0 0 6 年报告：F O L F O X 治疗A G C1 18 8 例， 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究前言 缓解率( R R ) 4 8 ( 2 9 , - - - 6 2 ) ，中位疾病进展时间( m T T P ) 5 7 月，中 位生存期( m O S ) 8 11 月。A 1 一B a t r a n ( A S C O ，2 0 0 6 ) 报告多中一已, R C T ( I I I ) 一线治疗A G C ，入组2 2 0 歹0 ，F L O ( L V 5 一F uc i v + O
8、 X A ) V SF L P ( L V 5 F ue i v + D D P ) ，结果R R ( ) 3 4 ：2 7 ( P = 0 0 1 2 ) ，m T T P ( f i J ) 5 7 ：3 8 ( P = 0 0 1 9 ) ，m T T F ( ) 寻) 5 3 ：3 I ( P = 0 0 2 8 ) 。3 4 级不良反应8 9 ：1 8 6 ( P = O 0 4 6 ) 。充分证明O X A 取 代D D P 与5 - F U 联合的优势有可靠证据。f l 了C u n n i n g h a m ( A S C O ，2 0 0 6 ) 报告 的R E A L 2
9、 试验，历时四年大样本多国多中心对照C A P 与5 F u 和0 X A 与 D D P 的E C FV SE C XV SE O FV SE O X 试验，入组总数1 0 0 2 例，结果R R E O X ( E P I ，O X A ，C A P ) 高于其他三组。m O S ( 月) ：E O X v sE C F 11 2 ：9 9 ( P = 0 0 2 5 ) 。E O X 有显著生存优势。O X A 已经成为治疗进展期胃癌 ( A G C ) 不可或缺药物。 O X A 是继D D P 币I I C B P 之后的第三代铂类广谱抗癌药，已在结肠癌、 胃癌等肿瘤化疗中占有重要地
10、位。周围神经系统毒性为其剂量限制性毒 性，主要表现为以末梢神经炎为特征的周围感觉神经病变，随着剂量的 累计还会出现疼痛性感觉障碍和功能障碍，有效降低0 X A 急性神经毒性 的发生率和严重程度有重要的临床意义。 相关资料表明，镁离子可以对抗自由基生成；镁是人体新陈代谢过 程中不可缺少的阳离子，对细胞内外离子的稳定具有重要的调节作用， 能稳定N a + K + A T P 酶活性，维持细胞膜的完整性；镁可阻滞天门冬氨酸 叫m e t h y l D a s p a r t a t e ，入n V I D A ) 受体，从而抑常I J N M D A 介导的神经细胞钙 离子内流，保护神经元。硫酸镁
11、能抑制中枢神经系统的突触传递，并能 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究 前言 抑制神经纤维的应激性。硫酸镁还能使镁依赖的A T P 酶恢复功能，利于 钠泵的运转。 大量临床试验证实硫酸镁能有效减轻O X A 所致的神经毒性，但是目 前尚无足够的临床证据及体外试验能够证实硫酸镁对O X A 的药效影响， 因此我们对硫酸镁对O A X 的药效影响进行了体外研究。本实验主要观察 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用，从而进 一步探讨其与化疗药物联合抗肿瘤作用的有关机制。 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C
12、 - 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究主要实验仪器设备 主要实验仪器设备 冰箱 恒温水箱 石英双重蒸馏水器 分光光度计7 2 1 型 L D Z 5 2 型自动平衡离心机 M M 1 微量振荡器 超净台 细胞培养箱 倒置相差显微镜 微量天平 恒温干燥箱 液氮生物容器 生物显微镜 酶联免疫检测仪 移液枪 流式细胞仪 中国海尔 上海医用恒温设备厂 江苏金坛市亿通电子有限公司 上海光谱仪器有限公司 北京医用离心机厂 上海徐新生化仪器厂 中国苏净集团安泰公司 贺利氏F u n c t i o nL i n e 重庆光学仪器厂 北京赛多利斯仪器有限公司 上海跃进医疗器械厂 成都金凤液氮容器有
13、限公司 日本奥林巴斯 南京华东电子集团 美国T H E R M O B e c t o n D i c k i s o n 公司 硫睃镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究材料与方法 1 实验材料 材料与方法 1 1 细胞系人胃癌S G C 7 9 0 1 细胞株由苏州大学附属第二医院实验 室馈赠( 购自中国科学院上海细胞生物学研究所) 。 1 2 实验试剂硫酸镁购自天津药业焦作有限公司。奥沙利铂( 艾恒) 购自江苏恒瑞医药股份有限公司；改良型R P M I 1 6 4 0 培养基购E l H y c l o n e 公司；新生牛血清购自杭州四季青公
14、司；D M S O 为国药集团化学试剂有 限公司产品；M T T 试剂为A m r e s c o 公司产品；A n n e x i nV E G F P P I 试剂 盒为南京凯基生物工程有限公司产品。 2 实验方法 2 1 细胞培养人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株培养于含1 0 小牛血清、 1 0 0 u m l 青霉素和1 0 0 u m l 链霉素的改良型R P M I 1 6 4 0 培养液中，培养条件 为3 7 。C 、5 C 0 2 、饱和湿度、每隔2 、3 天用0 2 5 胰酶消化传代一次。 2 2 奥沙利铂及硫酸镁浓度配制将5 0 m g 奥沙利铂溶入5 0 0 m
15、 l5 葡萄糖溶液配制成1 0 0 L t g m l 溶液，然后稀释2 倍，配制成5 0 0 0 9 9 m l 溶液， 另一组1 0 0 r t g m l 溶液，然后稀释1 0 倍，配制成1 0 0 0 t g m l 溶液，以备用于 流式细胞术检测细胞凋亡。将2 5 9 1 0 m l 支的硫酸镁依次稀释5 倍共配制 2 5 0 0 0 m g m l 、5 0 0 0 m g m l 、1 0 0 0 m g m l 、2 0 0 m g m l 四个浓度梯度，溶液 为5 葡萄糖溶液。 硫酸镁与奥沙利铂联合对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用的体外研究材料与方法
16、2 3 M T T 法测定硫酸镁联合奥沙利铂对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株 的增殖抑制作用经查阅文献及预实验计算出的奥沙利铂对人胃腺癌 S G C 7 9 0 1 细胞株5 0 生长抑制浓度，并以最接近I C 5 0 浓度( 终浓度约为 10 9 9 m 1 ) 和硫酸镁四个浓度梯度2 5 0 0 0 m g m l 、5 0 0 0 m g m l 、1 0 0 0 m g m l 、 2 0 0 m g m l ( 终浓度分别为5 0 0 0 m g m l 、1 0 0 0 m g m l 、2 0 0 m g m l 、0 4 0 m g m 1 ) 联合，测定对人胃腺癌S G C 7 9 0 1 细胞株增殖抑制作用。 2 3 1M T T 溶液的配制方法称取M T T 0 5 克，
