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1、第2 6 卷增刊 分析试验室 Y 0 1 2 6 S p p l 2007年10月ChineseJ o u m a lo fA h a l v s i sI b o r a t o r y2 0 0 7 一】O - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ I _ - _ - - _ _ 硫化镉纳米粒子标记寡核苷酸探针阳极 溶出法检测N O S 序列 钟江华，孙伟，焦奎 ( 青岛科技大学化学与分子工程学院，青岛2 6 6 0 4 2 ) 纳米粒子标记D N A 电化学检测是利用纳米粒 子标记寡核苷酸作为探针，与目标D N A 杂交后， 在一定条
2、件下检测纳米粒子或者溶出金属离子的 电化学信号，间接测定D N A 。将纳米粒子引入到 D N A 的电化学检测中，可以显著提高检测的灵敏 度，降低检出限【l 。 。 本文利用水相合成巯基乙酸修饰的C d S 纳米 粒子做为标记物用于转基因植物常见序列N O S 终 止子序列片断的电化学检测。在活化剂的作用下， 纳米粒子表面的羧基可以与探针s s D N A 序列一端 修饰的氨基偶联，实现纳米粒子对探针序列的标 记。在一定条件下，纳米粒子标记的探针序列与 固定在巯基乙醇自组装金电极上的目标序列发生 杂交反应，利用强酸溶解杂交产物中的C d S 纳米 粒子，以同位镀汞阳极溶出伏安法检测C d 2
3、 + 离子 的电化学信号，进而间接完成对目标序列的电化 学定性定量检测。 实验采用C I - I 8 4 0 B 电化学工作站( 上海辰华 仪器公司) ；常规三电极系统，工作电极为玻碳电 极，对电极为铂丝电极，参比电极为银氯化银电 极。目标序列为人工合成的N O S 启动子基因序列 片断，所用试剂如巯基乙酸、巯基乙醇、1 乙基3 ( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺( E D C ) 、N 羟基琥 珀酰亚胺( N H S ) 以及2 ( N 一吗啉代) 乙烷磺酸 ( 胍S ) 等均为分析纯。 实验方法如下：参照文献H 1 合成了巯基乙酸 修饰的C d S 纳米溶胶，取5m LC d S 纳米溶胶
4、离心 纯化后水洗后加入1 0 0 皿5 0m m o l LE D C 、1 0 0 止 5 0r m o l LN I - I S 及探针序列，室温下搅拌1 8h ，该 反应液在1 0 0 0 0r m i n 下离心3 0r a i n ，用P B S 洗涤 多次后再分散于少量P B S 中，得到C d S 纳米粒子 标记的s s D N A 。将预处理好的金电极浸入1 0 O m n m l L 巯基乙醇溶液中，室温下避光自组装1 2h ， 取出后得到巯基乙醇自组装膜修饰的金电极。将 S A M A u 电极浸入含5 0m m o l LE D C 和目标序列 的M E S 缓冲液中2
5、5 保持1 8h ，取出电极用大量 P B S 冲洗3m i n 除去多余D N A ，即可得到s s D N A 修 饰金电极。将固定了目标序列的金电极放入含有 C d S 纳米粒子的s s D N A 溶液中，4 0 水浴中反应 4 0r a i n 后用含0 1 S D S 的P B S 浸泡并冲洗电极， 除去未杂交的探针序列。用1 5 0 止1 0m o l L 删0 3 溶解电极表面的C d S 纳米粒子，将所得溶液移至2 m L0 1 m o l Lm C l 溶液中( 含2 7 1 0 。4m o l L H 孑+ ) 。以玻碳电极为工作电极，采用同位镀汞阳 极溶出法测定释放出的
6、C c l 2 + 离子，沉积时间3 0 0 8 ，沉积电位一1 2V ，以一0 8 4V 处阳极溶出峰为 测量信号。 将一系列不同浓度的目标序列固定在金电极 上，依照实验步骤进行检测。结果表明，随目标序 列浓度增大，溶出信号逐渐增大，对N o S 目标序 列检测的线性范围为8 0 1 0 一4 0 1 0 9 m o l L ，线性回归方程i 。( 肚) = 0 1 4 9 1 0 9 C ( p m o l L ) + 0 1 1 9 ( 7 , = 7 ，) ，= 0 9 9 4 ) ，检测限为 2 7 5 1 0 加m o l L ( 3 d ) 。考察了空白试验( 电极表 面未固定D
7、 N A ) 及对相同浓度的三碱基错配、非互 补和目标序列进行检测得到的溶出信号。在空白 试验中得到了较小的溶出信号，这可能是因为纳 米粒子与电极表面的非特异性吸附造成的；非互 补序列与空白试验对应的溶出信号相差不大；与 相同浓度的目标序列相比，三碱基错配的序列的 基金项目：国家自然科学基金( 2 0 删，2 0 6 3 5 0 ) 项目资助 作者简介：钟江华( 1 9 8 3 一) ，男，硕士研究生 通讯联系人：孙伟，男，博士，博士后，教授；T e l ：1 3 1 5 6 2 0 3 2 3 7 ；E - n m f l ：m n w e i q m t e d u - 1 8 2 - -
8、 - 第2 6 卷增刊 分析试验室 V 0 1 2 6 S u p p l 2 0 0 7 年1 0 月 C h i n e s eJ o u r n a lo fA 且a l v s i sL a b o r a t o r y 2 0 0 7 1 0 溶出信号较小，表明该方法对不同的序列有良好 的选择性。 参考文献 1 漆红兰，张成孝化学进展，2 0 0 5 ，1 7 ：9 1 1 2 W a n gJ ，L i uG ，P o L s k yRdd E l e e t r o e h e mC o m n u I i ， 2 0 0 2 。4 ：7 2 2 3 Z h u N N ，踟1
9、 1 9 A ，F a n g Y ze ta A n a l y s t ，2 0 0 3 ，1 2 8 ： 2 6 0 4 L i n ZB ，S u X G ，砜Hda ( ；h e mJ C h i n U n i v ，2 0 0 3 ， 2 4 ：2 1 6 C d Sn a n o p a r t i c l e sh b e l e de l e c t r o c h e m i c a ls t r i p p i n ga n a l y s i sf o rN O Ss e q u e n c e sd e t e c t i o n Z H O N G 五a n g
10、- h u a ，S U NW e i + a n dJ I A OK a r l ( C o l l e g eo fC h e n l i s t r ya n dM o l e c u l a rE n g i n e e r i n g ，Q i n g d a oU n i v e r s i t y o fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y ，Q i n 斟2 6 6 0 4 2 ) 创b s 打a c t ：I nt h i sp a p e ram e r c a p t o a c e t i ca c i d ( M A A ) m
11、o d i f i e dP 捌2 h T l i u ms u l f i d e ( C d S ) n a n o p a r t i c l ew a ss y n t h e s i z e d i na q u e o u ss o l u t i o na n du s e da so l i g o n u c l e o t i d e sl a b e l sf o rt h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no fn o p a l i n es y n t h a s e ( N O S ) t e r m i
12、 n a t o rg e n es t r u e n c e T h ec a I j 矾g r o u p so nt h e $ u l f a c eo fC d Sn a n o p a r t i c l ec a nb ee a s i l yc o v a l e n t l yl i n k e dw i t h N I - 1 2 一m o d i f i e dN O So l i g o n u c l e o t i d ep r o b es e q u e n o e s T h et a r g e ts s D N As e q u e n o e 唧f i
13、 x e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c eb y c o v a l e n f l yl i n k e do nam e r c a p t o e t h a n o l 鸵l f - a s s e m b l e dg o l de l e c t r o d ea n dt h eD N Ah y b r i d i z a t i o no ft a r g e ts s D N Aw i t h p r o b es s D N AW a Sa c c o m p l i s h e do nt h ee l e c t r o d
14、 es u r f a c e T h eC d Sn a n o p a r t i c l e sa n c h o r e dO i lt h eh y b r i d sc a l lb ed i s s o l v e di nt h es o l u t i o nb yt h eo x i d a t i o no f 脒0 3a n df u r t h t J rd e t e c t e db yas e n s i t i v ed i f f e r e n t i a lp u l s ea n o d i cs t r i p p i n g v o l t a m
15、 m e t r i cm e t h o d T h ed e t e c t i o nr e s u l t sC a nb eu s e df o rm o n i t o r i n gt h eh y b r i d i z a t i o na n dt h eN O St a r g e ts e q u e n c e w a ss a t i s f a c t o r yd e t e c t e di nt h er a n g eo f8 0 1 0 1 2 4 0 1 0 9 m o l Lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i ta s2 7 5 1 0 1 2 m o l L ( 3 d ) K e y w o r d s ：D N Ah y b r i d i z a t i o n ；C d Sn a n o p a r t i c l e ；N O Ss e q u e n c e ；A n o d l cs t r i p p i n gv o l t a m m e t r y ；G e n e t i c a l l ym o d i f l e d 叫嚣豇l i 娜 - 1 8 3 - -
