《硫氧还蛋白1的生物学功能研究对肝癌细胞HepG2和炎性细胞U937的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《硫氧还蛋白1的生物学功能研究对肝癌细胞HepG2和炎性细胞U937的影响（153页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学 博士学位论文 硫氧还蛋白-1的生物学功能研究对肝癌细胞HepG2和炎性细胞 U937的影响 姓名：唐文心 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：陈正望 20090705 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 摘摘 要要* 硫氧还蛋白（Thioredoxin, Trx）是一类小分子多功能蛋白，广泛存在于原核和真 核生物中，它们属进化保守的氧化还原蛋白家族，具有一个相同的-Cys-Gly-Pro-Cys- 的氧化还原活性中心。Trx-1 又称成人型 T 细胞性白血病衍生因子、类白细胞介素 1 细胞因子、早孕因子，是硫氧还蛋白家族中
2、研究最广泛的成员。Trx-1 与硫氧还蛋白 还原酶（Thioredoxin reductase 1, Trx R1）和 NADPH 共同构成一个重要的氧化还原 调节系统（Trx 系统），对细胞抵御氧化应激和维持细胞内正常的氧化-还原平衡具 有重要的作用。此外，Trx-1 也能作为促生长因子、转录因子激活剂、辅助因子及多 种酶的受体影响着细胞内环境及相应生理活动。 近年来，许多研究显示 Trx-1 和肿瘤的关系非常密切， 它可以调节肿瘤细胞中凋 亡通路、转录因子和某些功能蛋白酶的活性，进而影响着肿瘤的发生、发展、增殖、 凋亡及血管发生等生理过程。而且，过量表达的 Trx-1 导致肿瘤细胞对多种治
3、疗药物 产生耐药性。Trx-1 已经成为国际上肿瘤分子生物学研究中的热点，是一个极具临床 意义的肿瘤治疗的新靶点。 多项研究显示，对 Trx-1 进行翻译后修饰，如羟基氧化、S 亚硝基化或谷胱甘肽 化，将对其功能产生明显而重要的影响，而对 Trx-1 的磷酸化研究却未见报道。在 2005 年，对人肝癌细胞系 HepG2 的磷酸化蛋白组学研究中，首次发现 Trx-1 第 100 位苏氨酸（Thr）可磷酸化。为研究磷酸化修饰对 Trx-1 功能的影响，我们进行了以 下工作： 利用 PT-PCR 技术，从肝癌细胞系 HepG2 中得到 Trx-1 基因，构建了原核表达 载体 pET32a-Trx，通
4、过 E.coli 系统高效表达和 Ni-NTA 纯化，得到预期融合蛋白 His-Trx-1。 使用杂交瘤技术成功制备了三株抗Trx-1 单克隆抗体，均为IgG1（）亚型，其效 价均达 1:10000， 特异性高， 为后期通过Elisa及Western Blot方法研究该蛋白功能提供 了有力工具。 应用分子生物学技术，将 Trx-1 DNA 序列的第 299 位 A 突变为 C，即将其氨基 * 本研究课题得到国家自然科学基金（30370647，30470823） ， 国家 863 计划（2002AA214061）资助 I 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 酸
5、序列的第 100 位苏氨酸（Thr, T）突变为天冬酰胺（Asn, N） ，构建了两种真核表达 载体pcDNA-Trx和pcDNA-muTrx， 并分别建立了稳定表达Trx-1和muTrx-1的HepG2 细胞系。 用不同抗癌药刺激转染细胞，发现转染 muTrx-1 的细胞对药物的敏感性增强了， 更容易发生凋亡。同时发现 muTr-1 分子结合 ASK-1（凋亡信号激酶 1）的能力下降 了。这表明 Trx 蛋白分子 100 位的“T”的磷酸化有利于其发挥抗凋亡的生物活性， 其可能的机制是 T-100 的磷酸化有助于 Trx-1 和 ASK-1 的结合。 这对于开发针对 Trx 磷酸化的抗肿瘤药
6、物提供了新的思路。 随着炎-癌链概念的提出， Trx-1 也开始因其在各种炎症或应激疾病以及在炎症通 路中的作用而受到关注。而一种新的多功能炎性蛋白 DT/AIF-1 被发现于型糖尿病 自身免疫反应的胰腺炎组织和慢性移植排斥反应的同种大鼠异体移植的心脏中，能 促进多种炎症细胞，包括巨噬细胞、淋巴细胞和单核细胞的增殖、迁移和分泌。为 探讨 Trx-1 与 DT/AIF-1 的相互调节关系，我们进行了如下研究： 将重组质粒 pcDNA-AIF-1 转染人单核白血病细胞株 U937， 与对照组相比， 发现 DT/AIF-1 水平的升高，但并不影响细胞内 Trx-1 的水平。而外源添加 DT/AIF-
7、1 却能 显著提高胞内 Trx-1 水平。 将两个重组质粒 pcDNA-Trx 和 pcDNA-NLS-Trx 分别转染人细胞株 U937，均能 显著提高细胞内 DT/AIF-1 的蛋白水平及细胞的 DT/AIF-1 的分泌；同时发现，胞质 中 Trx-1 对 DT/AIF-1 的转录水平没有影响，而细胞核内的 Trx-1 则可以使 DT/AIF-1 的 mRNA 水平显著提高。 这说明不同的亚细胞定位的 Trx-1 对 DT/AIF-1 的调控方式 是有差异的： 胞质中的 Trx-1 在翻译水平正调控 DT/AIF-1， 而 Trx-1 入核后在转录水 平对 DT/AIF-1 进行正调控。
8、以上研究结果表明，细胞内的 Trx-1 促进了 DT/AIF-1 的表达和分泌，而分泌到 细胞外的 DT/AIF-1 则反过来促进了 Trx 在细胞内的表达。因此本文提出了 Trx-1 和 DT/AIF-1 的调控是互动模式的。 上述结果有利于进一步深入研究 DT/AIF-1 在心血管 疾病的形成和器官移植中炎症发生的机理。 关键词：关键词：硫氧还蛋白-1 蛋白磷酸化 大炎肽/同种异体炎症因子-1 肝癌 炎症 细胞增殖 细胞凋亡 II 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 Abstract* Thioredoxins are small ubiquitous
9、multifuncational proteins which belong to a conserved redox-active protein family containing the conserved active catalytic domain (-Cys-Gly-Pro-Cys-). Trx-1 is the most studied member in thioredoxin family, which has been rediscovered under different names, including adult T cell leukemia-derived f
10、actor (ADF), interleukin-2 (IL-2) receptor-inducing factor produced by human T-lymphotrophic virus type 1 (HTLV-1)-infected T cells and early pregnancy factor. Trx-1 has been discovered to have a multiplicity of biological functions. Besides the well-known antioxidant effect with thioredoxin reducta
11、se（TrxR） through the NADPH-dependent process (Trx system), Trx-1 also contributes to many of the hallmarks of cancer including increased development, proliferation, resistance to cell death and increased angiogenesis. Trx-1 regulates the apoptotic signaling pathways and the activity of some transcri
12、ption factors or functional enzyme in tumor cells. In some cancer cell lines, Trx-1 expression may confer resistance to chemotherapy. These findings suggest that the Trx-1 may represent a novel attractive target for development of new cancer therapeutics. Trx-1 can undergo different post-translation
13、al modifications such as S-nitrosylation/S-nitrosation, thiol-oxidation and glutathionylation. These modifications have been demonstrated to significantly affect the Trx-1 function. In contrast， phosphorylation of Trx-1 has not been investigated. In 2005，Trx-1 was first reported phosphorated on Thr-
14、100 via Global phosphoproteome analysis on human HepG2 hepatocytes using reversed-phase diagonal LC. In order to explore how the phosphorylation of Trx-1 affects its function, we carried out the following work: Trx-1 gene was obtained from human HepG2 hepatocytes by RT-PCR and the eukaryotic vector
15、pET32a-Trx was constructed. Recombinant protein His-Trx-1 was produced by E.coli after induced by IPTG and then puried by Ni-NTA agarose. Three stable hybridoma cell lines were successfully established to secret anti-Trx MAbs. All these MAbs belong to the G1 subclass with light chains with high affi
16、nity * This work was supported by grants from the National Science Foundation of China （30370647，30470823） ，Chinese 863 Program （2002AA214061） III 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 and specificity. Two recombinant eukaryotic vectors, pcDNA-Trx and pcDNA-muTrx（A299C） were constructed.The two transfected HepG2 cell lines, which could stably express Trx-1 or muTrx-1（T 100N）were established, respectively. Stable transfection of HepG2 cell line with muTrx-1 cDNA showed higher sensitivity a
