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1、河北医科大学 博士学位论文 硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤的作用及其机制研究 姓名：王平 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：张建新 20080401 英文缩写 英文缩写( a b b r e v i a 虹o n ) 缩写英文全称 A L I A c u t el u n gi n j u r y L P S L i p o p o l y s a c c h a r i d e H 2 SH y d r o g e ns u l f i d e N a r i SS o d i u mh y d r o s u l f i d e P P G D L - p r o p a r g
2、 y l g l y c i n e C S E C y s t a t h i o n i n e - 7 一l y a s e C B S C y s t a t h i o n i n e p s y n t h a s e I L 一11 3I n t e r l e u k i n - l1 3 I L 一1 0 I n t e r l e u k i n 1 0 A M a l o n d i a l d e h y d e S O D S u p e r o x i d ed i s m u t a s e G S H P x G l u t a t h i o np e r o
3、 x i d a s e F C MF l o wc y t o m e t r y N F r BN u c l e a rf a c t o r - r B 王C A M 一重I n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e 1 P S P u l m o a l v e r o l a rs u r f a c t a n t 式0l lA l v e o l a rt y p el le p i t h e l i a lc e l l s S P A P u l m o n a r ys u r f a c t a n t
4、p r o t e i n A S p B P u l m o n a r ys u r f a c t a n tp r o t e i n B S P C P u l m o n a r ys u r f a c t a n tp r o t e i n C T PT o t a lp r o t e i n T P L T o t a lp h o s p h o l i p i d s R T - P C RR e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n 中文译名 急性
5、肺损伤 脂多糖 硫化氢 氢硫化钠 炔丙基甘氨酸 胱硫醚一y 一裂解酶 胱硫醚一1 3 一合成酶 自介素- 11 3 白介素- 1 0 丙二醛 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化酶 流式细胞术 核内转录因子。r d 3 细胞问黏附分子一l 肺表面活性物质 肺泡l l 型上皮细胞 肺表面活性蛋自焱 肺表面活性蛋白B 肺表面活性蛋白C 总蛋自 总磷脂 逆转录一聚合酶链反 应 1 9 英文缩写 I H C I m m u n o c y t o c h e m i c a l B A L FB r o n c h o a l v e o l a r l a v a g ef l u i d M T T M
6、 e t h y l t h i a z o l y lt e t r a z o l i u m 免疫组织化学 支气管肺泡灌洗液 甲氮甲唑兰 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学 位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材 料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则， 承担相应的法律责任。 研究生签名：幸 导师签 嚣懋 归枷日薹童壤霎 河北医科大学 研究生学位论
7、文独创性声明 本论文是在导师指导下进, 7 7 i 拘研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究生硌沙4 - 聊虢艇秒 富年牛月另口日 中文摘要 硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤的作用及其机制研究 摘要 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y ，A L I ) 是指由心源性以外的各种肺内 外致病因素所导致的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭，主要表现为顽固性 呼吸困难、低氧血症、肺顺应性降低等。细菌感染所致的脓毒血症是引起 A L I 的主要原
8、因，革兰氏阴性菌( g r a m n e g a t i v eb a c t e r i u m ，G ) 细胞壁的 主要成分脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，L P S ) 是主要的致病因素，利用L P S 复制A L 薹的动物模型进行研究是科研工作中的常用手段之。 内源性硫化氢( h y d r o g e ns u l f i d e ，H 2 S ) 主要由半胱氨酸等含硫氨基 酸在胱硫醚B 合成酶( c y s t a t h i o n i n e 1 3 s y n t h a s e ，C B S ) 和胱硫醚一Y 一裂 解酶
9、( c y s t a t h i o n i n e - 7 1 y a s e ，C S E ) 作用下生成，它对神经系统特别是海 马的功能具有调节作用，并可以调节消化道和血管平滑肌的张力。随着对 H 2 S 研究的逐渐深入，越来越多的证据证实它参与多种呼吸系统疾病的发 生发展过程，是继一氧化氮( n i t r i co x i d e ，N O ) 和一氧化碳( c a r b o n m o n o x i d e ，C O ) 之后的一种新型气体信使分子。本实验首先观察了在内 毒素性A L I 病程中H 2 S 和C S E 的时程性变化，在此基础上分别给予H 2 S 供体氢硫化钠
10、( s o d i u mh y d r o s u l f i d e ，N a r i S ) 和C S E 抑制剂炔丙基甘氨酸 ( D L p r o p a r g y l g l y c i n e ，P P G ) ，观察它们对肺组织氧化应激、炎症细胞、 炎症介质、细胞凋亡和肺表面活性物质( p u l m o a l v e r o l a rs u r f a c t a n t ，P S ) 等方面的影响，从细胞、基因、蛋白水平多层次、多方面探讨H 2 S 在肺 损伤中的作用及机带| j ，为临床治疗肺损伤提供理论依据。 第一部分L P S 致大鼠急性肺损伤硫化氢胱硫醚一Y
11、裂解酶体系的变化 目的：观察大鼠内毒索性A L I 过程中自贪素1 ( I L ) 、自介素1 0 ( I L 1 0 ) 和H 2 S C S E 体系的时程性变化及关系，探讨L P S 诱导A L I 的发 病机制。 方法：健康雄性S D 大鼠( 2 7 0 1 2 0 9 ) 共8 0 只，随机分为6 组，I 空白对照组；I IL P S1h 组；I I I L P S3h 组；I V L P S6h 组；V L P S9h 组； V I L P S1 2h 组，空白对照组共鹌只( 不同时间点各8 只) 。用2 0 的乌 拉坦( 5m l k g ) 麻醉大鼠，L P Slh 、3h 、
12、6h 、9h 和1 2h 组舌静脉注射 中文摘要 L P S ( 5m g k g ) 。分别于给药1h 、3h 、6h 、9h 及1 2h 后采集样品；检 测肺系数和肺湿仟重比的变化；去蛋白法检测血浆中H 2 S 含量、距甲基 蓝法检测肺组织C S E 活性、酶联免疫吸附法( E L I S A ) 检测血清中匝一l p 和纯一l O 的变化；光镜、电镜观察肺组织病理变化。 结果： 1 空白对照组大鼠肺系数和肺湿干重比在lh 1 2h 之间无明显变 化。给予L P Slh 后大鼠肺系数和肺湿仟重比与空白对照组比较无显著差 异( O 4 7 4 - 0 0 2V S0 4 6 a ：0 0 3
13、 ，4 6 5 4 - 0 3 4V S4 4 1 4 - 0 3 3 ，P 0 0 5 ) ，给予 L P S3h 后肺系数和肺湿汗重比开始明显升高( O 。5 2 - - t ：0 。0 3V S0 4 7 4 - 0 0 3 ， 5 2 4 4 - 0 A 5V S 4 4 3 4 - 0 2 1 ，P 0 0 5 ) ，给予L P S6h 、9h 和1 2h 后肺系数 和肺湿干重比均比空白对照组升高且维持在较高水平( P O 0 5 或尸 O 0 1 ) 。 2 空白对照组大鼠血清中亿1 侈和I 己一1 0 浓度在lh 1 2h 之闶无明 显变化。给予L P Slh 屠大鼠盘清中也。1
14、 1 3 I 浓度较空白对照组显著升高 ( 1 1 1 8 4 - 0 。5 9V S 9 2 6 4 - 1 。3 7 ，P 0 。0 5 ) 并达高峰，给予L P S3h 、6h 、9h 及1 2h 后血清中I L 1 p 浓度较L P S1h 随时程延长逐渐下降，但与空白对 照组比较均明显升高( P 0 0 5 或P 0 0 1 ) 。给予L P Slh 后大鼠血清中 I L 1 0 浓度较空自对照组显著升高( 2 1 3 4 6 4 - 1 2 8 4V S1 1 8 4 4 - 1 2 5 ，P 0 0 1 ) ， 给予L P S3h 时达高峰( 2 3 0 。4 6 + 9 4 9
15、V S1 0 7 3 4 - 9 9 7 ，P 0 0 5 ) ，给予L P S3h 后血浆中H 2 S 含量和肺组织C S E 活 性明显降低( 2 4 9 0 4 - 2 2 1V S3 6 6 7 4 - 5 3 5 ，3 3 5 4 - 0 9 8V S4 6 1 + 0 6 8 ，P 0 0 1 ) ， 给予L P S6h 、9h 和1 2h 后血浆中H 2 S 含量和肺组织C S E 活性与空白对 照组比较均明显降低( J P 0 0 1 ) 。 4 高倍光镜下显示，空白对照组肺泡结构完整，给予L P Slh 后无明 显变化，给予L P S3h 、6 h 、9h 及1 2h 后肺组
16、织明显受损，可见肺泡间 隔增宽，肺泡完整性被破坏，腔内有大量渗出，炎性细胞浸润。电镜下显 2 中文摘要 示，空白对照组肺泡l I 型上皮细胞超微结构基本正常，给予L P S1h 后无 明显变化，给予L P S3h 、6h 、9h 及1 2h 后肺组织超微结构明显受损， 粗面内质网脱颗粒，线粒体水肿、嵴减少嗜锇性板层小体的板层结构显著 融合或消失。 结论：大鼠静脉注射L P S 后，lh 时肺组织未出现明显损伤，但炎性 细胞因子显著升高。给予L P S3h 至1 2h 时均存在肺损伤，I L 1 D 和I L 1 0 均明显升高，内源性H 2 S 和C S E 均明显降低。I L 1 p 、I L 1 0 和H 2 S C S E 体系可能参与内毒素性A L I 的病理生理过程。 第三部分硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤组织氧化应激的影响 冒的：观察H 2 S 对大鼠内毒素性A L l 组织过氧
