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1、Y1 4 0 7 2 7 2 分类号：R 3 1 8 1 4 密级： 学位类别：科学学位口 专业学位口 学校代码 学号： 100 6 2 2 0 0 5 2 1 8 2 天蚌酱科鼻垮 T I A N J I NM E D I C A LU N I V E R S I T Y 硕士学位论文 M A S T E R SD I S S E R T A T l 0 N 论文题目：硫化氢对大鼠结肠平滑肌细胞的舒张作用及机制的 研究 TITLE - S t u d yo nt h eR e l a x a t i o nE f f e c t sa n dM e c h a n i s mo f H 2
2、S o nR a tC o l o n i cS m o o t hC e l l s 一级学科：临床医学 二级学科：内科学 消化系病 论文作者：程英 指导教师：王邦茂教授 导师组成员：杨玉龙教授 天津医科大学研究生院 二o o 八年五月 天沣医科人学硕十学位论文 中文摘要 目的：本课题旨在研究硫化氢( H 2 S ) 对离体单个结肠平滑肌细胞舒缩作用的影 响；并进一步研究H 2 S 对结肠平滑肌细胞的舒缩作用是否通过改变A T P 敏感钾 离子通道( K A l l P 通道) 的活性引起，从而探讨H 2 S 调节胃肠道动力的机制。 方法：制备W i s t e r 大鼠单个结肠平滑肌细胞悬
3、液。用H 2 S 供体硫氢化钠( N a S H ) ， N a S H + K A T P 通道抑制剂格列本脲( G l i ) ，K A T P 通道开放荆毗那地尔( P i n ) 处 理大鼠结肠平滑肌细胞，在倒置相差显微镜下观察，应用图象分析系统测量细 胞长轴的长度，观察药物对细胞舒缩作用的影响。 结果： 1 N a S H 组作用时间为6 0 s 组的细胞平均长度大于作用时间为3 0 、1 2 0 s 组 ( P 0 0 5 ) ， 并且使高浓度N a S H ( 6 0g m o l k g ) 对直结肠的扩张作用消失，即L N A M E 可以 逆转N a S H 对C R D
4、的抗伤害作用。以上研究提示N O 可以与H 2 S 在消化系统也起到 正协同作用，W a n g 等2 1 】认为N O 调节内源性H 2 S 水平可能通过如下机制：N O 可直接作用于C S E 蛋白中亚硝基所含自由的巯基，增力 I C S E 活性。N O 可直接 增加平滑肌C S E 的转录水平，从而上调C S E 表达。N O 可提高c G M P 依赖的蛋白 激酶活性从而激活C S E 。N O 可促进细胞摄A , C S E 作用的前体物质半胱氨酸。 鉴于N O 对H 2 S 的调节需要一定时间依赖性，非瞬时性，而本实验为离体的结肠 平滑肌细胞，实验要求在细胞酶解分离后l d ,
5、时内完成，所以未能进行H 2 S 和N O 1 9 天津医科人学硕士学位论文 是否对结肠平滑肌细胞也有协同作用的研究。 二、激活K A T P 通道可能是H 2 S 舒张结肠平滑肌细胞的机制之一 对细胞离子通道的研究已经证实平滑肌细胞的离子通道病是引起疾病的病 理基础。以往人们仅认为三磷酸腺苷是细胞内能量贮存的主要化合物而参与机 体的能量供应，而几乎从未考虑过细胞内A T P 可能是正常条件下许多细胞功能的 信息调节剂。随着研究的深入发展，研究者逐步发现A T P 除作为能量供应物质以 外，还有信息分子的作用。 1 9 8 3 年N o m a 2 2 】发现细胞A T P 浓度和其它核苷酸可
6、抑制豚鼠心室肌细胞 选择性钾通道，1 0 年后他f l i t 2 3 l 用膜片钳技术首先在心肌细胞上发现和证实了 K A T P 通道的存在，而后又相继在胰腺B 细胞、脑神经元、骨髂肌、平滑肌细胞、 肾小管上皮细胞和线粒体内膜等部位发现了类似的通道，它在机体多种生理及 病理过程中发挥着重要的调节作用1 2 4 。 K A T P 通道是钾离子通道总族中的一族。K A W 通道是由4 个构成离子孔道的结 构蛋白K i r 6 X ( 6 1 6 2 ) 与4 个调节亚单位磺脲类受体( S U R s ) 共同构成的八聚 体1 2 玉2 6 1 。当组织缺氧或细胞内A T P 浓度低于I m
7、m o l L 时，该通道便被大量激活， 产生一束非时间依赖性的K + 流。与其它钾离子通道不同的是，K A T P 通道的开放或 关闭不受细胞膜电压的调节，其激活也无需c E + 参与，而是由细胞内核苷酸浓 度调节的。因此，K A T P 通道的活性与细胞代谢及细胞膜兴奋性有密切关系【2 n2 8 1 。 目前已有3 种S U R 被克隆：S U R I ( 主要位于胰腺) 、S U R 2 A ( 主要位于心脏) 和S U R 2 B ( 主要位于血管平滑肌细胞) 。S U R 隶属于A T P 结合蛋白家族，其上有 磺脲类药物和钾离子通道开放剂的结合位点。电生理学研究证实：上述物质不 是
8、直接作用于K i r 6 X ，而是通过作用于S U R 上各自相应的结合位点而调控着 K i r 6 x 2 9 】，因而S U R 尸, 被作为药物作用的靶点【3 0 1 。因此，K A T P 通道所含S U R 的种 类的不同，使得K A T P 通道对K A T P 通道开放剂、抑制剂的反应具有组织特异性。 格列本脲是临床常用的口服降糖药，为第二代磺脲类药，它可与胰腺0 细胞 K A T e 通道结合，抑制钾离子外流，致使细胞膜去极化，增强电压依赖性钙通道开 放，胞外钙内流，胞内游离钙浓度增加后，触发胞吐作用及胰岛素的释放，发 挥降血糖作用。因为格列本脲是一种高效高选择性的K A T
9、 P 通道的抑制剂，它不仅 可与胰腺p 细胞，而且与心肌细胞和脑组织的K A T e 通道的S U R 有很强的亲和力 p V 2 1 ，所以它已经成为实验中常用的K A T P 通道抑制剂的代表药物。 吡那地尔为第1 代选择性的K A T P 通道开放剂，它能激活血管平滑肌K A T P 通道， 2 0 大津医科人学硕十学位论文 引起血管舒张，血压下降，临床上主要用于治疗原发性高血压 3 3 】，也是目前实 验中经常使用的K A T P 通道开放剂代表药物。吡那地尔只能通过S U R 2 ( S U R 2 A 和 S U R 2 B ) 而不是通过S U R l 激活K A T P 通道1
10、 3 0 J 。 最近，关于H 2 S 在血管系统作用中最有意义的进展是确定了血管平滑肌细胞 细胞膜上的K A T P 通道是H 2 S 作用的靶蛋白。一系列的实验证实了这一点，Z h a o 。7 】 用2 0 和1 0 0m m o l L 氯化钾( c h l o r a t u mK a l i u m ，K C l ) 预收缩鼠主动脉环，由H 2 S 诱导的最大血管舒张作用分别是9 0 和1 9 。这一血管舒张能力的不同反映了 H 2 S 的作用，部分是由钾电流调节的。此外，H 2 S 的血管舒张作用可以被K A T P 通道 开放剂吡那地尔模仿，被K A T P 通道阻滞剂格列本脲
11、所抑制。这些从血管组织得到 结果已通过全细胞膜片钳技术在分离的血管平滑肌细胞得到证实：鼠主动脉平 滑肌细胞K A T P 通道电流可被H 2 S 明显地增强。以上实验表明，H 2 S 可以对K A T P 通 道产生舒张血管的作用。此外这些实验同时还表明：H 2 S 对K A T P 通道的作用是直 接的，而不是通过干涉A T P 代谢而起作用，因为在这些实验中，细胞内的A T P 含量是恒定的，在溶液中洗去H 2 S ，其作用立刻消失，而改变细胞内A T P 浓度 ( 0 2 “ - 3m m o l L ) ，并不能改变H 2 S 对K A T P 通道电流的作用。因此，H z S 是一个
12、重 要的血管活性因子，是第一个被确定的血管平滑肌细胞K A T P 通道气体开放剂。 Z h a o 等【1 8 】实验证明H 2 S 是一种K A T P 通道开放剂，H 2 S 通过兴奋K A T P 通道可以增加 K A T P 通道的钾离子外流，使细胞膜出现超极化而使平滑肌舒张，该实验结果己被 全细胞膜片钳实验所证实。此P b H 2 S 的扩血管作用还具有删F C a 2 + 依赖性。C a 2 + 的跨膜转运对平滑肌的收缩具有直接的作用，用硝苯地平( 电压f t 空c E + 通道抑 制剂) 和无c a 2 + 孵液可降低H 2 S 舒张效应，表明H 2 S 可能同时通过减少细胞夕
13、F C a 2 + 内流而舒张血管。 C h o i 3 4 】等人通过全细胞膜片钳技术证实，毗那地尔可以激活大鼠离体结肠 平滑肌细胞的外向电流，而这种作用可以被格列本脲抑制，该实验表明在肠道 平滑肌细胞上存在K A l P 通道。Y o k o s h i k i 3 5 1 通过电位钳位法测得吡那地尔可以使 大鼠结肠平滑肌细胞的钾离子外流，使静息电位由一7 0 m v ，增至一7 5 m v ，即可 引起细胞膜电位的超极化。该实验结果表示吡那地尔引起大鼠结肠平滑肌细胞 钾离子外流的半数有效浓度( 5 0 e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n
14、，E C 5 0 ) 与以往报道的 吡那地尔引起大鼠血管平滑肌细胞的钾离子外流的E C 5 0 非常接近，所以据此推 测大鼠结肠平滑肌细胞上K A T P 通道的S U R 亚型可能与其血管平滑肌细胞的相似。 随后K o h 弘J 通过反转录一聚合酶链式反应( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i n 天津医科人学硕十学位论文 r e a c t i o n ，R T P C R ) 证实大鼠结肠平滑肌细胞上K A T P 通道由K i r6 2a n dS U R 2 B 组 成，而没有发现有K
15、 i r6 1 ，S U R l 和S U R 2 A 的存在。 肠道的运动来源于肠壁平滑肌收缩，细胞P I C a 2 + 内流产生内向电流，导致平 滑肌细胞膜去极化，从而形成动作电位升支，同时激活细胞内K + 外流形成外向 电流，使细胞膜逐渐复极化至静息电位。神经递质和胃肠道激素通过受体和第 二信使系统作用于这些离子通道，从而对肠道平滑肌电生理和收缩活性进行调 节p 引，所以平滑肌细胞膜的膜电位是胃肠道动力的影响因素之一。毗那地尔可 使豚鼠平滑肌细胞膜超极化，抑制细胞动作电位产生并抑制细胞收缩活动，而 K A l l P 通道特异性阻断剂格列本脲可以拮抗吡那地尔的作用，说明K A T P
16、通道活性的 变化对细胞膜电位振荡和分节律收缩的发生有重要作用【37 1 。K o h 3 8 1 发现鼠类结肠 平滑肌细胞在生理状态下，其细胞膜上的K A T P 通道部分处于开放状态而参与细胞 膜静息电位的形成，当用格列本脲使这些处于开放状态的通道关闭后会使细胞 膜发生去极化而增加细胞的兴奋性。 此外，许多国内外学者通过实验均提示通过激活肠道平滑肌细胞上的K A T P 通道可以减少和抑制离体回肠、结肠肌条对各种刺激因素引起的收缩作用。Y u a n 1 3 9 J 在放置豚鼠回肠( g u i n e ap i gi l e u m ，G P I ) 标本的浴槽加入吡那地尔时，可以使豚 鼠回肠的自主收缩运动减弱，此外吡那地尔可以抑制由5 一H T 3 受体激动剂引起 的豚鼠回肠收缩反应，并且在0 5 “ - ，5 p m o l L 范围内，随着剂量的增加，其抑制收 缩作用越明显。路新强等人m 】在浴槽给予氧化震颤素以直接激动平滑肌M 受 体，诱发豚鼠离体回肠的收缩，吡
