白术、玉屏风散和增液汤的口服免疫佐剂作用研究

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1、浙江大学动物科学学院 博士学位论文 白术、玉屏风散和增液汤的口服免疫佐剂作用研究 姓名：李瑞丽 申请学位级别：博士 专业：动物营养与饲料科学 指导教师：胡松华 20090401 浙江大学博士学位论文 摘要 摘要 疫苗免疫接种是防治动物传染病的一个重要手段，但在很多情况下动物注射 疫苗后不能产生有效的免疫应答。因此，如何提高动物疫苗的免疫效果是畜牧业 生产上的一个重要问题。研究发现一些中药可以增强机体的免疫机能，从而提高 疫苗的免疫效果。浙江省出产的道地药材“浙八味”久负盛名，它们是白术、白 芍、浙贝母、杭白菊、延胡索、玄参、麦冬，温郁金八味中药材。本论文系统研 究浙八味中药以及含浙八味中药的玉

2、屏风散和增液汤的口服免疫佐剂作用，为进 一步开发浙八味中药提供参考。 1 浙八味中药对小鼠注射模式抗原卵清白蛋白( O V A ) 的口服佐剂作用比较 目的筛选浙八味中具有口服免疫佐剂作用的中药。方法以雌性I C R 小鼠 为实验动物，将浙八味设为高、中、低三个剂量水平，每只小鼠分别灌胃0 2 5m L 不同水平的中药，每日一次，连续给药4d ，然后分别在第5d 和第2 5d 进行皮 下注射抗原O V A ，并在二免后2 周进行眼眶采血。结果与对照组相比，浙八味 中的白术能显著提高O V A 受免小鼠血清中O V A 特异性I g G 总抗体及抗体亚类 I g G 2 a 、I g G 2 b

3、 和I g G 3 抗体水平( P o 浙江大学博士学位论文 第四章白术对小鼠注射卵清白蛋白( O V A ) 的口服佐剂作用研究 t - - “ o o 三 v 、 寸 喜8 o 口C O F l t r o l口R A MO 0 5 目R A MO 2 R A M0 8 IgG】lgG2aI g G 2 b I g G 3 抗体亚类I g Gi s o t y p e s 图4 - 2 不同剂量的白术对血清中O V A 特异性抗体亚类的影响 F i g u r e4 - 2E f f e c to f R A M 蚰O V A - , s p e e i f i eI g G l ，I g

4、 C 2 a ，I 瓯1 2 ba n dI 霉G 3 蛔啪o f m i c e 不同字母表示差异显著( P ooEc on寸一州早Qo 臼术、笪璺墼塑望堕望竺旦壁墨垄竺型堡旦竺窒 一 5 O 4 0 3 0 2 0 1 O 0 0 口S a l i n e C o r t A ( 5 I ，t g ) L P S ( 7 5 9 9 ) 刺激物M i t o g e n s 图孓3 不同剂量的白术对淋巴细胞增殖的影响 r i g u r e5 - 3E f f e c to fR A M o nt h ep r o l i f e r a t i o no fs p l e n o c y

5、 t e si s o l a t e df r o mm i c e 不同字母表示差异显著( P 0 0 5 ) 。 芒。芒ou工7仁一一一E嚣d)卿钲星五匡 浙江大学博士学位论文第六章含白术饲料对口蹄疫疫苗免疫的口服佐剂作用研究( 试验一) 表7 - 2 不同处理的白术对小鼠体重的影响 T a b l e7 - 2D i f f e r e n tt r e a t m e n t so fR A Mo fR A MO l l lt h ew e i g h to fm i c e 不同字母表示差异显著( 尸oo靼oo 浙江大学博士学位论文第六章含白术饲料对口蹄疫疫苗免疫的口服佐剂作用研究

6、( 试验二) 2 2 对淋巴细胞增殖的影响 脾脏淋巴细胞增殖的试验结果与体液免疫的结果一致，如图8 3 所示，5 白术煎煮处理后饲喂2d 、4d 和6d 均能显著促进C o n A 或者L P S 诱导的F M D 疫苗免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应( 尸 0 0 5 ) 。 4 2 3 5 2 8 2 1 1 4 0 7 O O a 口C o n V o l囵D - 2 d囫D - 4 dD - 6 d a a 一一a 一一a 一一 a b 一b 聂 C o n A 刺激物M i t o g e n s L P S 图& 3 饲喂不同天数的白术对琳巴细胞增殖的影响 F i g8 - 3E f

7、f e c to fd i f f e 他n td a y sf e e d i n go fR A M O Rt h ep r o l i f e r a t i o no fs p l e n o e y t e si s o l a t e d f r o mm i c e 不同字母表示差异显著( P 0 0 5 ) 。 D a t aw i t hd i f f e r e n tl e t t e r sa r es t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n t 伊 0 0 5 ) 2 3 对细胞因子的影响 如图8 - 4 ( A ) ( B )

8、所示，5 白术煎煮处理后饲喂2d 、4d 和6d 能分别提 高的I F N - Y 和I L 一5 的水平( P 0 0 5 ) 。 8 5 ) ( 。它譬H co一葛一3_IJ=纂i：蜂一长 自术、至量垦墼塑丝婆望塑呈壁墨壅竺型堡旦翌壅一一一 _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - I _ _ _ _ _ _ - - - _ _ - - _ _ _ - _ 一一一 ( A ) C o n t r o lD 2 d 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 O ( B ) C o m r o lD 2 d 图& 4 饲喂不同天数的白木对c o

9、n A 刺激下脾脏淋巴细胞产生细胞因子的影响 F i gS - 4E f f e c to f d i f f e r e n td a y sf e e d i n go f R A M O nI F N - T ( A ) a n dI L - 5 ( B ) p r o d u c t i o nb y m o u s es p l e n o c y t e ss t i m u l a t e dw i t hC o nA 不同字母表示差异显著( P 0 0 5 ) D a t aw i t hd i f f e r e n tl e t t e r sa r cs t a t i

10、s t i c a l l yd i f f e r e n t ( J P 0 0 5 ) 。 表8 - 2 饲喂不同天数的白术对小鼠体重的影响 T a b l e8 - 2E f f e c to fd i f f e r e n td a y sf e e d i n go fR A M O Rt h ew e i g h to fm i c e 分组 G r o u p 首免前 B e f o r ei m m u n i z a t i o n 加强免疫前B e f o r e b o o s t e r 加强免疫后3 周 3w e e k sa f t e rb o o s t e

11、 r 一一 C o n t r o l 2 3 9 34 - 1 1 6 2 9 9 74 - 1 6 5 3 3 9 04 - 3 0 3 D 2 d D - 4 d D 6 d 2 3 7 9 士0 8 9 3 0 1 74 - 2 0 8 3 2 8 94 - 2 2 2 2 3 9 0 士1 4 5 3 0 3 34 - 2 3 9 3 3 4 04 - 2 9 9 2 3 7 1 士1 0 3 2 9 2 04 - 1 4 6 3 2 5 14 - 2 0 3 一一一 不同字母表示差异显著( P 0 0 5 ) D a t aw i t hd i f f e r e n tl e t

12、 t e r sa r cs t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n t ( P 0 0 5 ) 盟c 8 n-1_一E岂一咧妊gn1H 枷 枷 抛 咖 湖 鲫 伽 抛 。 盟u3lu8上zdI一一E暑d)剜钲g上-z生 浙江大学博士学位论文第六章含臼术饲料对口蹄疫疫苗免疫的口服佐剂作用研究( 试验- - ) 3 小结 在本研究中，我们使将煎煮处理后的白术以5 的量混入饲料中，饲喂小鼠 以期提高0 型F M D 疫苗的免疫效果。在将白术的添加水平提高以后，对O 型 F M D 疫苗的免疫反应显著提高，不仅提高机体的体液免疫，同时提高机体对口 蹄疫病毒的细胞

13、免疫，表明煎煮白术适用于O 型F M D 疫苗的佐剂应用。至于 白术的饲喂时间长短，2d 、4d 和6d 差异并不显著，这方面的机理有待于进一 步的研究。 白术、玉屏风散和增液汤的口服免疫佐剂作用研究 试验三白术佐荆对小鼠小肠I g A 分泌细胞的影响 1 材料与方法 1 1 仪器设备 烘箱，G N P 9 1 6 0 型，上海精宏实验设备有限公司。 石蜡切片机，H M3 4 0 E 型，美国。 N i k o nE c l i p s e8 0 i 显微镜，N I SE l e m e n t sB R2 3 0 软件拍照。 1 2 主要试剂 酶消化液： a 、0 1 胰蛋白酶液：用0 1

14、C a C l 2 ( p H7 8 ) 配制。 b 、O 4 胃蛋白酶液：用O 1 N 的H C l 配制。 A P E S ：S I G M A 公司进口分装。 3 甲醇H 2 0 2 溶液：用3 0 H 2 0 2 和8 0 甲醇溶液配制。 中性树胶，国药集团化学试剂有限公司。 H a r r i s 苏木素，S I G M A 进口分装。 抗I g A 为兔来源的多克隆抗体，丹麦D A K O 公司 山羊抗兔I g G 抗体H R P 多聚体，丹麦D A K O 公司 D A B 显色液，丹麦D A K O 公司 1 3 试验方法 1 3 1 试验分组与给药 本试验取试验二中的对照组和

15、D 2 d 组的小鼠为免疫组化材料，分别在首免 后一周和二免后3 周摘取小肠组织。 1 3 2 组织石蜡切片 肠组织标本在中性缓冲福尔马林( p H7 2 7 4 ) 固定2h 后取材再固定4k 开始如下脱水，自来水洗3 0 分，7 0 乙醇3 0 分，9 5 乙醇l h 2 次，1 0 0 乙 醇l h 2 次，二甲苯透明2 0m i n 2 次。然后使用5 8 6 0 。C 石蜡浸蜡3 h ，使用 浙江大学博士学位论文第六章含白术饲料对口蹄疫疫苗免疫的口服佐剂作用研究( 试验三) 6 0 6 2 。C 石蜡包埋组织。切片，厚3 4t x m ，连续切片，捞片( 对于组化的切片 应在预先A P E S 处理的载玻片上) ，6 0 6 2 。C 烘箱烤片4 h 后免疫组化染色。 1 3 3 石蜡切片的I g A 免疫组化染色 ( 1 ) 石蜡切片，二甲苯脱蜡、无水乙醇、9 5 、8 0 、7 0 L 醇至水化， 蒸馏水洗； ( 2 ) 抗原暴露：采用胰酶消化3 7 0 C1 5r a i n ，蒸馏水洗，然后用P B S 洗涤 3 次，每次5m i n ， ( 3 ) 3 H 2 0 2 阻断内源性过氧化物酶1 0m i n ，P B S 洗5m