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1、华中科技大学 硕士学位论文 癌性微环境下NGF对HSCp75NTR表达及细胞凋亡的影响 姓名：石玉香 申请学位级别：硕士 专业：病理学 指导教师：官阳 20090501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 癌性微环境下癌性微环境下 NGF 对对 HSC p75NTR 表达及表达及 细胞凋亡的影响细胞凋亡的影响 导 师 官 阳 研究生 石玉香 摘 要 摘 要 目的目的 本文旨在观察癌性微环境下肝星状细胞（HSC）神经营养素低亲合力受体 p75 （p75NTR） 、神经营养素高亲合力受体酪氨酸激酶 A（TrkA）的表达状况及神经生长 因
2、子（NGF）对 HSC 两种受体表达及细胞生存状态的影响，为深入了解肝癌细胞与 间质细胞的相互作用提供实验依据。 方法方法 1、MTT 法检测不同时间、不同浓度肝癌细胞（HepG2）上清液作为条件培养基 （取 12h、24h、48h 的条件培养基分别按 18 、14 、12 的比例用无血清 DMEM 稀释）对 HSC 增殖的影响，取促增殖作用最强的一组条件培养基作为实验用条件培 养基。 2、流式细胞仪（FCM）检测单纯培养 HSC、肝癌细胞条件培养基处理 HSC、肝 癌细胞条件培养基与不同浓度 NGF（1、10、100g/L）共同作用下 HSC 的细胞周期 和凋亡率变化。 3、免疫组织化学（I
3、HC）半定量检测单纯培养 HSC、肝癌细胞条件培养基处理 HSC、肝癌细胞条件培养基与不同浓度 NGF 共同作用下 HSC 的 -平滑肌肌动蛋白 （-SMA） 、p75NTR、TrkA 的蛋白表达，用计算机图像分析系统半定量分析。 4、透射电镜（TEM）观察单纯培养 HSC、肝癌细胞条件培养基处理 HSC、肝癌 细胞条件培养基与 NGF 共同作用下 HSC 的超微结构改变。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 结果结果 1、MTT 结果显示：48h 的肝癌细胞条件培养基在 12浓度时对 HSC 的促增殖 作用最强。 2、FCM 结果
4、显示：与单纯培养的 HSC 相比，肝癌细胞条件培养基作用的 HSC 增殖指数升高，凋亡无明显变化；肝癌细胞条件培养基与 NGF 共同作用于 HSC 后， 随着 NGF 浓度的增加，细胞凋亡率增加，但对细胞增殖无明显影响。 3、免疫组化结果显示：-SMA、P75NTR、TrkA 在各组的 HSC 中均有表达。与 单纯培养组相比，肝癌细胞条件培养基组的 HSC 表达 -SMA、P75NTR、TrkA 均有 不同程度的增加， 在肝癌细胞条件培养基中加入 NGF 后， HSC 表达 -SMA、 P75NTR 有随 NGF 浓度增加而增加的趋势，而表达 TrkA 有随 NGF 浓度增加而减少的趋势。 4
5、、透射电镜结果显示：单纯培养的 HSC 细胞形态完整，极少见凋亡细胞。肝癌 细胞条件培养基作用的 HSC，可见细胞增殖活跃，易见核分裂象，凋亡不明显。在肝 癌细胞条件培养基中加入 NGF 后，HSC 凋亡数目随 NGF 浓度的增加而增多，并可见 不同时期的凋亡细胞。 结论结论 单纯培养的 HSC 表达 p75NTR 和 TrkA。HSC 经肝癌细胞条件培养基作用后，其 p75NTR、TrkA 的表达均增强。但在条件培养基中加入 NGF 后，HSC 的 p75NTR 表 达增强、TrkA 表达减弱，细胞凋亡增加。提示在癌性微环境中 NGF 能促进 HSC 的凋 亡。这种作用可能与 NGF 增强
6、HSC 的 p75NTR 表达、抑制 TrkA 的表达有关。本结 果为我们深入了解肝癌微环境中肿瘤细胞与间质细胞的相互作用机制提供了实验依 据。 关键词关键词: 肝癌细胞；肝星状细胞；条件培养基 p75NTR；TrkA ；NGF 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 The Effect of NGF on p75NTR expression and Apoptosis of HSC in Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma ABSTRACT Objective This stud
7、y is designed to detect the expression level of p75NTR (low-affinity nerve growth factor receptor) and TrkA (tyrosine kinase A, high-affinity nerve growth factor receptor) in HSC under microenvironment of hepatocellular carcinoma, and to investigate the effect of NGF on the expression of these two r
8、eceptors and on the cell survival, providing experimental data for deeper understanding of the interaction between hepatoma cells and interstitial cells. Methods: 1. HepG2 culture medium of 12h, 24h, 48h, diluted to 1:8, 1:4, 1:2 respectively, as conditioned medium (CM) were added to HSC, and then M
9、TT method was used to examine HSC proliferation under different conditions, CM with the strongest effect on cell multiplication was selected as CM for further experiment. 2. Changes in cell cycle and apoptotic rate of normally cultured HSC, HSC treated with CM, HSC treated with CM in the presence of
10、 NGF at different concentration (1, 10, 100g/L) were examined via FCM. 3. IHC was applied to determine the expression level of -SMA, p75NTR, TrkA in HSC of three experimental groups as described above. Semiquantitative analysis was performed using a Computer Image Analysis System. 4. Observe the ult
11、rastructural changes of HSC of three experimental groups by TEM. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 Results: 1. The result of MTT showed that the group treated with CM of 48h diluted to 1:2 was the most effective one in enhancing cell proliferation. 2. The result of FCM assay showed th
12、at compared with the group of DMEM, a significant increase of proliferation index in the group of CM was observed, but the change of apoptosis rate was not remarkable. Apoptosis rate of HSC cultured in CM with NGF increased with increasing concentrations of NGF while the proliferation remained almos
13、t unaffected. 3. The result of IHC showed that HSC of each group expressed -SMA, P75NTR, TrkA. However the expression of -SMA, P75NTR and TrkA in HSC treated by CM of HepG2 increased at different levels when compared with the group of DMEM The expression levels of -SMA and P75NTR in HSC treated with
14、 CM of HepG2 and NGF had a tendency to increase along with increasing concentrations of NGF, however, the expression level of TrkA had a tendency to decrease when the concentration of NGF increased. 4. The result of TEM showed that HSC cultured in DMEM remained intact and few apoptosis could be foun
15、d. In CM group there were more active proliferation and mitoses was easily seen, no apoptosis was observed. But HSC at different stages of apoptosis could be observed in the group of CM with NGF, and the number of apoptosis increased with increasing concentrations of NGF. Conclusions: HSC expressed
16、p75NTR and TrkA when cultured in DMEM in vitro. The expression levels of p75NTR and TrkA both increased in the CM group. The expression levels of p75NTR in HSC treated with CM of HepG2 and NGF increased in a NGF concentration-dependent manner. However, the expression level of TrkA decreased as the concentration of NGF increased, at the same time, apoptosis increased,.This results 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 indicated that NGF could induce HSC apoptosis in m
