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1、福建医科大学 硕士学位论文 瘦素对大鼠胰岛细胞胰岛素合成与分泌的影响 姓名：王丽红 申请学位级别：硕士 专业：内科学（内分泌与代谢） 指导教师：陈诺琦 20091001 瘦素对大鼠胰岛1 3 细胞胰岛素合成与分泌的影响 摘要 背景和目的胰岛素抵抗和胰岛0 细胞功能障碍是2 型糖尿病发病机制中的两 个重要环节，现已明确胰岛B 细胞功能异常是2 型糖尿病发生的关键因素。因而， 探讨影响胰岛B 细胞功能的相关因素，减少胰岛B 细胞损伤及保护并恢复其功能， 是防治2 型糖尿病的关键。 瘦素( 1 e p t i n ) 是近年发现的由脂肪细胞分泌的细胞因子，可调节食欲和脂肪 代谢、参与免疫功能的调控等
2、。瘦素对胰岛B 细胞功能的影响主要体现在对胰岛素 的直接调节作用。研究不同浓度瘦素对体外培养大鼠胰岛B 细胞胰岛素合成和分泌 的影响，可为了解2 型糖尿病发病机理及胰岛B 细胞功能保护提供理论和实验依据。 方法用含1 1 1 m m o l L 葡萄糖的R P M I1 6 4 0 培养液体外培养大鼠胰岛1 3 细胞 系胰岛素一1 ( i n s u l i n 一1 ，I N S 一1 ) 细胞。然后，将实验分为A 、B 、C 、D 和E 五组， 培养液瘦素浓度分别为O 斗g L 、5 p g L 、l O g g L 、2 0 “g L 和5 0 L 。培养2 4 小时后 分别以荧光定量P
3、 C R 和E L I S A 方法检测I N S 一1 细胞前胰岛素原m R N A 的表达及上清 液胰岛素浓度。 结果( 1 ) A 、B 、C 、D 和E 组胰岛B 细胞前胰岛素原m R N A 表达相对比值分别 为0 4 7 1 0 0 2 1 、0 3 6 5 0 0 1 7 、0 2 6 7 0 0 1 0 、0 1 9 9 0 0 1l 和0 1 6 4 0 0 1 0 ， 胰岛B 细胞前胰岛素原m R N A 表达相对比值随培养液瘦素浓度的升高而下降。B 组与 A 组比较、C 组与B 组比较、D 组与C 组比较、E 组与D 组比较，差异均有统计学意 义( P 均 0 0 5 ，
4、各组的方差在 口= 0 0 5 水平上没有显著性差异，即方差具有齐性。方差分析结果显示F = 3 7 8 3 6 4 ， P 0 0 1 ，5 个实验组前胰岛素原m R N A 表达并不完全相同。 1 2 前胰岛素原m R N A 表达：多组间均数比较选择L S D 法，任何两组均值进行两两比 较，差异均有显著性( P 均 0 0 5 ) 。其中，B 组与A 组比较、C 组与B 组比较、D 组 与C 组比较、E 组与D 组比较均显著下降，差异有统计学意义( P 均 0 0 5 ，各组的方差在 口= 0 0 5 水平上没有显著性差异，即方差具有齐性。方差分析结果F = - 8 5 9 7 7 ，
5、P 0 0 1 ， 5 个实验组上清液胰岛素浓度并不完全相同。 2 2 上清液胰岛素浓度：多组间均数比较选择L S D 法，任何两组均值进行两两比较， 差异均有显著性( P 均 0 0 5 ) 。其中，B 组与A 组比较、C 组与B 组比较、D 组与C 组比较、E 组与D 组比较均显著下降，差异有统计学意义( P 均 O 0 5 ) 。 表1 瘦素对胰岛1 3 细胞前胰岛素原m R N A 表达的影响( x s ) 注：B 组与A 组比较，+ P ( 0 0 5 ；C 组与B 组比较，“P ( 0 0 5 ；D 组与C 组比较，”+ 尺0 0 5 1 E 组与D 组比较，”“P ( 0 0 5
6、 。且任何两组均值进行两两比较，P 均 O 0 5 。 2 1 表2 瘦素对胰岛1 3 细胞胰岛素分泌的影响( x s ) 注：B 组与A 组比较，+ P O 0 5 ；C 组与B 组比较，“P O 0 5 ；D 组与C 组比较，”。P O 0 5 ；E 组与D 组比较，“”只O 0 5 。且任何两组均值进行两两比较， 尸均 0 0 5 。 O51 01 52 02 53 03 54 0 4 55 0 培养液瘦素浓度( J X g L ) 注：B 组( 5 “g L ) 与A 组( O “g L ) 比较，f ( O 0 5 ；C 组( 1 0J Z g L ) 与B 组( 5 g L ) 比
7、较，P O 0 5 ；D 组( 2 0 9 9 L ) 与C 组( 1 0 n g L ) 比较，P ( O 0 5 ；E 组( 5 0 肛g L ) 与D 组( 2 0 P - g L ) 比较，f ( O 0 5 。 图1 6 瘦素与胰岛1 3 细胞前胰岛素原m R N A 表达的关系 6 5 4 3 2 l O O O O O O O 斛懈S丕E隧懈曰餐柱霉器血田篷 O 6 O 5 O 4 0 3 0 2 O 1 O A 组B 组C 组D 组E 组 注：B 组与A 组比较，P ( O 0 5 ；C 组与B 组比较，P ( O 0 5 ； D 组与C 组比较，P ( O 0 5 ；E 组与
8、D 组比较，只O 0 5 。 图1 7 瘦素与胰岛1 3 细胞f j 胰岛素原m R N A 表达的关系 皇 一 蘧 蛏 懈 曰 鳘 餮 妲 J 0 51 01 52 02 53 03 54 04 55 0 培养液瘦素浓度( I t g L ) 注：B 组( 5 1 J g L ) 与A 组( 0 P g L ) 比较，P ( O 0 5 ；C 组( 1 0 p , g L ) 与B 组( 5 V - g L ) 比较，P ( O 0 5 ；D 组( 2 0 P g L ) 与C 组( 1 0 I J - g L ) 比较，尺0 0 5 ；E 组( 5 0 t a g L ) 与D 组( 2
9、0 P g L ) 比较，P ( O 0 5 。 图1 8 瘦素与上清液胰岛素浓度的关系 列群g蚕吕隧懈曰塔垤霉霖。回鳘 8 6 4 2 0 8 6 4 2 3 3 3 3 3 2 2 2 2 3 8 3 6 3 4 一 吕 三3 2 3 冀3 0 懈 塞2 8 餮 蜓2 6 U 2 4 2 2 A 组B 组C 组D 组E 组 注：B 组与A 组比较，P O 0 5 ；C 组与B 组比较，T O 0 5 ； D 组与C 组比较，f ( O 0 5 ；E 组与D 组比较，P O 0 5 。 图1 9 瘦素与上清液胰岛素浓度的关系 讨论 人口的老龄化及人们生活方式的改变，糖尿病特别是2 型糖尿病发
10、病率逐年上 升。糖尿病的病因目前还未明确，可能与遗传、免疫、环境等因素有关。随着对2 型糖尿病研究的深入，现已明确胰岛素抵抗和胰岛B 细胞功能障碍是2 型糖尿病发 病机制中的两个重要环节，其中胰岛0 细胞功能异常是2 型糖尿病发生的关键因素。 因而，探讨影响胰岛B 细胞功能的相关因素，减少胰岛B 细胞损伤及保护并恢 复其功能，是防治2 型糖尿病的关键。 1 9 9 4 年美国学者Z h a n g 等首先克隆出小鼠和人的肥胖基因产物一瘦素副 ( 1 e p t i n ) ，它是一种多肽激素，由1 6 7 个氨基酸残基组成，分子量1 4 1 6 K D ，具 有强亲水性。瘦素主要由白色脂肪组织
11、分泌，而胃粘膜、骨骼肌、乳腺、胎盘、骨 髓、垂体等处也能分泌一定量的瘦素n 引。正常啮齿动物，血瘦素生理浓度范围为0 l O “g L n “ 。瘦素有广泛的生物学效应，可调节食欲和脂肪代谢、参与免疫功能的调 控等，特别是与糖尿病之间更有着复杂深刻的联系。而瘦素与糖尿病之间最直接紧 密的联系莫过于瘦素与胰岛素的相互作用。 S i v i t z 等通过给正常S D 大鼠急性静脉注射瘦素，发现瘦素可提高正常S D 大鼠体内胰岛素的敏感性，并增加胰岛素刺激的摄糖作用n 引。K a m o h a r a 等换用脑室 内注射瘦素的方法也可得到相似结果n 钔。国外有的学者利用转基因方法，将含有瘦 素c
12、 D N A 的载体注射入o b o b 小鼠的肌肉内，均观察到胰岛素功能改善，如胰岛素敏 感性增加，糖耐量低减恢复，以及高血糖、高胰岛素血症得到改善嘞一。说明瘦素 可在整体水平上促进胰岛素的功能。 有关瘦素对离体大鼠胰岛分泌胰岛素的直接调节作用的研究国外有较多报道晦一 7 8 1 。瘦素对胰岛分泌胰岛素的调节作用随不同瘦素浓度、不同葡萄糖浓度和不同作 用时间的不同而不同。国内谢锭乜2 1 等利用细胞培养技术，在不同的葡萄糖浓度( 5 6 m m o l L 或1 6 7m m o l L ) 和不同的瘦素作用时间( 1 0 分钟或2 小时) 下，以0 腿L 、 l “g L 、5 肛g L
13、、l O 肛g L 、1 5 p g L 、5 0 p g L 和1 0 0 p g L 瘦素作用于大鼠胰岛，用放免法 检测培养物上清液胰岛素浓度。结果显示，培养液葡萄糖浓度为5 6m m o l L 、培养 1 0 分钟的情况下，l t g L 、5 肛g L 瘦素促进被孵育的胰岛的胰岛素分泌；培养液葡萄 糖浓度为5 6m m o l L 、培养2 小时的情况下，5 “g L 瘦素促进胰岛素分泌，5 0 L 瘦素抑制胰岛素分泌。葡萄糖浓度为1 6 7m m o l L 、培养1 0 分钟的情况下，5 0 垤L 瘦素抑制胰岛素分泌；葡萄糖浓度为1 6 7m m o l L 、培养2 小时的情况
14、下，5 9 9 L 瘦素抑制胰岛素分泌。说明重组瘦素对离体大鼠胰岛分泌胰岛素具有双向作用，并受 瘦素浓度、作用时间和环境葡萄糖浓度等因素变化的影响。 由于体内除葡萄糖外的其他刺激因子对胰岛素分泌的调节受血糖浓度的影响， 随血糖浓度的变化而变化。为了了解瘦素在高糖状态下对胰岛B 细胞功能的影响， 本研究选择培养液葡萄糖浓度为1 1 1 m m o l L 。某些物质( 如葡萄糖、白细胞介素一1 、 游离脂肪酸和磺脲类药物等) ，短时间作用可刺激胰岛素分泌，长时间作用则抑制 胰岛素的分泌乜都，瘦素对胰岛B 细胞分泌胰岛素的直接作用可能也遵循这一规律。 为了了解瘦素长时间作用对胰岛B 细胞功能的影响
15、，本课题选择了2 4 小时进行研 究。 本研究选择体外培养大鼠I N S 一1 细胞，观察重组瘦素对胰岛B 细胞胰岛素的 合成与分泌的影响。以培养液葡萄糖浓度为1 1 1m m o l L 培养大鼠工N S 一1 细胞，然 后，将实验分为A 、B 、C 、D 和E 五组，培养液瘦素浓度分别为O 肛g L 、5 p g L 、l O “g L 、 2 0 腿L 和5 0 p g L 。培养2 4 小时后分别以荧光定量P E R 和E L I S A 方法检测胰岛B 细 胞前胰岛素原m R N A 的表达及上清液胰岛素浓度。结果显示，在葡萄糖浓度为 1 1 1 m m o l L 、瘦素作用时间2
16、 4 小时的情况下，瘦素对胰岛B 细胞胰岛素的合成与 分泌有抑制作用，并且随浓度增加抑制作用越明显。与国内谢锭乜2 1 等关于瘦素对离 体大鼠胰岛分泌胰岛素的双向影响的研究结果类似。 瘦素抑制胰岛素分泌的机制可能与下列因素有关：瘦素与胰岛B 细胞上的瘦 素受体结合以后，抑制前胰岛素的m R N A 表达，降低胰岛素基因启动子转录活性，减 少胰岛素的合成n0 1 。瘦素与胰岛B 细胞上的瘦素受体结合以后，通过激活A T P 敏感的K + 通道而下调c A M P ，抑制胰岛素的分泌他3 | 。瘦素与胰岛B 细胞上的瘦素受 体结合以后，通过P I 。一K + ( 磷脂酰肌醇K + ) 途径激活K + 作通道，8 细胞超极化，阻 止C a 2 + 内流，胞浆中C a 2
