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1、华中科技大学 博士学位论文 癌基因Gfi-1在急性髓系白血病中的表达及意义 姓名：常伟 申请学位级别：博士 专业：内科学（血液） 指导教师：孙汉英 20070401 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I 中文摘要 前 言 中文摘要 前 言 癌基因和肿瘤抑制基因一直是肿瘤发病的研究热点。目前认为造血系统恶性疾病 是由于细胞的异常增殖和成熟障碍所引起，且是一个多步骤的过程，第一步往往是由 于控制细胞生长的基因异常表达或其编码蛋白功能异常。调控细胞转化最常见的一类 基因是以转录因子形式起作用的那些基因，它们最终导致细胞转录调控异常。当前白
2、 血病发病机理研究一方面集中于具有特异染色体移位和特异基因重排的病种，如 t(8;21)和 AML1/ETO, t(15;17)和 PML/RAR a 等;另一方面在于调节细胞生长增殖、凋 亡及信号传导的非特异基因。由于具有特异融合基因表达的急性白血病越来越多，因 此白血病发生发展有关的非特异基因研究仍是目前研究的焦点。 Gfi-1 的癌基因潜能是作为一个大鼠 T 细胞淋巴瘤的 MOMULV 的整合位点而发 现的。已在神经胶质瘤，乳腺癌，子宫内膜癌等大量肿瘤中发现了该基因的异常。目 前的研究发现 Gfi-1 参与了细胞的生长，细胞周期调节，信号传导通路的调控，在肿 瘤的发生和转移中起到非常重要
3、的作用。 所有这些研究提示 Gfi-1 可能是一个癌基因， 并在肿瘤的发病机制中有关键性的作用。 急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一个有着不同种类的染色体 异常和基因突变的克隆性疾病，我们研究了急性髓系白血病中 Gfi-1 表达和临床的相 关性。我们用 RT-PCR 方法检测了处于不同病程中的 AML 患者 Gfi-1 的表达情况，分 析了其与初治 AML 细胞免疫表型与急性髓系白血病的某些生物学特性及其病程有 关。并检测了 Gfi-1 蛋白在 AML 中的表达，用 confocal 观察了 Gfi-1 蛋白在 AML 细 胞中的亚定位。并在造血组细胞中
4、观察了 Gfi-1 基因和蛋白的表达。并用阿霉素处理 HL-60 细胞，观察对细胞增殖分化、凋亡过程中 Gfi-1 及凋亡蛋白 Bax 和 Bcl-2 的关 系。对明确化疗药物治疗白血病的可能机制进行了进一步的研究，并为癌基因 Gfi-1 作为肿瘤治疗的新靶点提供实验依据。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 II 第一部分 癌基因 Gfi-1 在急性髓系白血病中的表达及意义 第一部分 癌基因 Gfi-1 在急性髓系白血病中的表达及意义 目的目的 了解急性髓系白血病细胞中Gfi-1基因的表达情况及其与临床的关系。 方法方法 1. 5
5、株白血病/淋巴瘤细胞系(HL-60, Jurkat, K562， U937, Molt-4 ), AML 患者 92 例（M1 17 例、M2 30 例、M3 16 例、M4 4 例、M5 21 例、M6 4 例） 。初诊 AML73 例，完全缓解（AML-CR）19 例。采用 RT-PCR 和 Western-blot 方法，分别检测了以 上 5 株白血病/淋巴瘤细胞系和 AML 骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclearcell， BMMNC）中 Gfi-1 的表达。并以 10 例非肿瘤性血液病患者(包括缺铁性贫血、溶血性 贫血、特发性血小板减少性紫癜等)和 5 例健康
6、供者骨髓作为正常对照。 2.我们对92例急性髓系白血病中Gfi-1基因阳性表达率与患者的一些临床指标(患 者的年龄，性别，肝脾有无肿大，外周血白细胞记数)进行相关性分析，我们根据外周 血白细胞计数将白血病患者分为2组：肿瘤低负荷组:外周血WBC20109 /L；肿 瘤高负荷组:具备外周血WBC20109 /L。 3.用激光共聚焦显微镜观察Gfi-1蛋白在骨髓MNC的表达和分布。 结果结果 1. 通过 RT-PCR 发现在所检测的 5 株白血病/淋巴瘤细胞系(HL-60, Jurkat, K562， U937 和 Molt-4)中，细胞系 Gfi-1mRNA 均呈阳性表达,但程度不一。HL-60
7、, K562 和 Jurkat 细胞 Gfi-1 基因呈明显的强阳性表达(R1.0) （R =Gfi-1 DNA 条带与 -actin DNA 条带吸光度的比值） ，在 U937, Molt-4 中呈现中等强度的表达(0.6所述方法进行。 1)分离胶与浓缩胶的浓度分别为 10%和 8%。 2)待测细胞裂解液和蛋白分子量标准首先加入 4变性凝胶上样缓冲液，100 煮 沸 5min。 3)然后依次加入上样孔中。 4)电泳开始时电流为 80mA/cm 凝胶， 染料进入分离胶后， 电流加大到 100mA/cm 凝胶， 5)继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 6)取下凝胶，用转移缓冲液浸泡数分钟
8、， 7)然后进行转膜。 4. 4 蛋白印迹反应蛋白印迹反应 电泳结束后， 用半干蛋白转移装置将蛋白转移到硝酸纤维素滤膜(NC 膜)上， 按转 移蛋白的常规方法进行。 1)剪 6 块新华 1 号滤纸和 1 块 NC 膜，其大小与 SDS-PAGE 电泳凝胶的大小完全 相同。 2)将剪好的滤纸与 NC 膜在转移缓冲液中浸泡 3-5min。 3)按顺序安装转移装置:平放底部电极，在底部电极上放置 3 张浸泡好的滤纸，精 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 12 确对齐，用玻棒挤出所有气泡。 4)将 NC 膜放在滤纸上，精确对齐，排除气泡。
9、5)把 SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去离子水中漂洗 5min，平放于 NC 膜上，左下角 作一标记，在其上再放置 3 张浸泡好的滤纸，排出气泡。 6)将上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶面积按 0.65mA/cm2 接通电源， 电转 3-3.5h。 7)转移结束后，去除滤纸。 8)把凝胶转移到考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。 9 将转移上蛋白的 NC 膜浸在 5%脱脂奶 4封闭一小时后， 10)将膜与第一抗体兔抗人(1:1000 稀释)孵育过夜， 11)然后用洗膜 3 次，每次 15min TBST 洗涤。 12)将膜与 HRP 标记的羊抗兔 IgG (1: 20
10、00 稀释)共同孵育 1.5h， 13 )洗膜 3 次，每次 1 5min。 14)最后用 ECL 法检测(Pierce 公司)。 15)X 线片放射自显影，扫描，拍片。 16)采用计算机 HMIAS-2000 型图像分析软件测定相应条带的平均吸光度值，结 果以各实验组吸光度值与 -actin 吸光度值的比值（灰度值灰度值）表示。 4.5. 统计学处理 实验数据以均数标准差表示,所有数据采用 SPSS11.5 医学统计学软件处理。 组间差 异比较按单因素方差分析 F 检验。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 13 三、结三、结 果果
11、 1. Gfi-1mRNA 在白血病细胞系中的表达在白血病细胞系中的表达 在所研究的 5 株人白血病/淋巴瘤细胞株中均可检测到 Gfi-1 基因表达，但程度不 一，如图 1-1 所示。在 HL-60, Jurkat, K562，U937 和 Molt-4 细胞中，HL-60, K562 和 Jurkat 细胞 Gfi-1 基因呈明显的强阳性表达(R1.0)，在 U937, Molt-4 中呈现中等强度 的表达(0.6R0.05, P 0.01 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 21 四、结四、结 论论 1. Gfi-1 在白血病/淋
12、巴瘤细胞系中有广泛表达。 2. Gfi-1 基因在白血病细胞中的表达存在异质性。 在 AML 患者中表达水平明显高 于正常人，在 AML 缓解期表达与正常人表达无显著差异。 3.按照 FAB 分型， Gfi-1 基因在 AML 各亚型中均比正常人表达增高。 但各亚型之 间无差异。 4. Gfi-1 阳性表达率与患者性别、年龄、肝和/或脾肿大均无显著相关，但与 AML 患者白细胞数具有一定的相关性。 五、讨论五、讨论 本研究主要是在分子水平和蛋白水平对 Gfi-1 在白血病细胞包括白血病/淋巴瘤细 胞系和急性髓系白血病患者中的表达做一检测，初步探讨 Gfi-1 与急性髓系白血病的 关系。 急性白
13、血病是我国常见恶性肿瘤之一，在成年人中以急性髓细胞性白血病多见。 化疗是目前治疗急性髓系白血病最基本与重要的手段，但化疗药物毒副作用大，复发 率也较高；骨髓移植费用昂贵，配型困难，以及移植后 GVHD 产生限制了临床广泛 开展。 虽然化疗仍然是最重要的治疗手段， 但现在基因治疗已经成为肿瘤治疗的热点。 因此白血病发生发展有关的非特异基因研究成了一个新的热点。 Gfi-1 的癌基因潜能是作为一个大鼠 T 细胞淋巴瘤的 MOMULV 的整合位点而被 发现的，它是淋巴细胞，中性粒细胞和造血干细胞的多能调节子1，Gfi-1 被表达在胸 腺和骨髓。通过 lck 邻近的启动子定位到 T 细胞所构建的 Gf
14、i-1 转基因的表达使鼠在 低频度发展成 T 细胞淋巴瘤。Gfi-1 在中性粒细胞分化中的基本作用直到近来基因靶 向实验中才被揭示。缺乏 Gfi-1 的鼠意外地出现了中性粒细胞减少。在这些鼠中成熟 的中性粒细胞缺乏并且它们的髓系前体细胞在粒细胞克隆刺激因子（G-CSF）的治疗 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 22 下也不能分化成成熟的粒细胞。有着不成熟的粒细胞核巨噬细胞前体细胞特征的不典 型的Gr1+Mac1+细胞在这些鼠的骨髓中集聚。 Dahl R16等通过Gfi-1(+/-) 和 PU.1(+/-) 大 鼠的杂交实验观察到杂合
15、鼠中 PU.1 基因使其髓系表型得到了恢复，但不能复原粒细 胞的分化，从而得出结论，Gfi-1 抑制了 PU.1 的活性，并且在 Gfi-1(-/-) 髓细胞中这种 抑制的缺乏促成了具有中性粒细胞和巨嗜细胞特征的混合细胞的出现。在体外筛选的 缺乏 Gfi-1 的前体细胞使 Gfi-1 重新表达在 G-CSF 的治疗下能挽救中性粒细胞分化。 以上的研究强烈提示了 Gfi-1 在中性粒细胞分化中的实质作用。 Gfi-1 直接以一个序列 特异性的方式连接 DNA， TAAA （T/G） CAC （A/T） GCA， 在那儿只有核序列 AA （T/G） 是不变的8。 Gfi-1 调节髓系和淋巴系细胞生
16、成的机制正在随着真正的体内靶基因的识 别而开始形成。以前，仅仅只有一个细胞基因，前凋亡因子 Bax 直接被 Gfi-1 所抑制 9。Bermd Rodel 等10已经证明在真核细胞中 Gfi-1 能和 STAT3 抑制蛋白 PIAS3 相互 接触而增强 STAT3 的信号。为了鉴别 Gfi-1 靶基因，Zhijun Duan11做了一套 34 个侯 选基因的大规模 CHIP 测定。这些侯选基因和造血生成有关，特别是和粒细胞生成有 关。一系列功能不同的 16 个真正 Gfi-1 靶基因被识别，包括细胞周期调节子，转录因 子，粒细胞特异性标志物，细胞因子和髓系分化终末标记物。在这些基因中，ELA2 在中性粒细胞分化中有一个至关重要的作用。它的杂合子的突变是两个主要遗传性中 性粒细胞减少（SCN 和 CN）的最初原因12。Richard E Person13等发现 Gfi-1 突变造 成了人中性粒细胞减少，并且它的靶基因是 ELA2。基因编码的转录因子 C/EBP、 C/EBP 和 ELA2 已经被证明对粒细胞生成是重要的。另一
