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1、浙江大学动物科学学院 博士学位论文 瘤胃产甲烷菌定量检测与微生物菌群调控研究 姓名：郭嫣秋 申请学位级别：博士 专业：动物营养与饲料科学 指导教师：刘建新 20080401 浙江人学博士学位论文 瘤胃产甲烷菌定量检测与微生物菌群调控研究 摘要 瘤胃甲烷的生成不仅是饲料能量的损失，而且通过暖气排入大气的甲烷是一 种重要的温室气体。随着全球对温室气体排放的重视，反刍动物瘤胃甲烷生成受 到越来越多的关注。本研究在建立分子生物学手段检测瘤胃产甲烷菌及微生物菌 群的基础上，通过探讨不同调控途径对瘤胃产甲烷菌和微生物菌群的影响，研究 产甲烷菌和微生物菌群与甲烷生成的密切关系。首先利用实时定量P C R 方
2、法， 建立瘤胃产甲烷菌及微生物菌群的检测技术( 第一部分) ；然后利用产甲烷菌选 择性抑制剂研究产甲烷菌与微生物菌群的变化( 第二部分) ，并以天然调控剂茶 皂素为调控手段探讨其对产甲烷菌及瘤胃微生态的影响( 第三部分) ；最后模拟 高粗日粮条件，探讨甲烷生成与瘤胃微生态的关系( 第四部分) 。 第一部分瘤胃产甲烷菌及微生物菌群分子研究方法的建立 建立实时定量P C R 方法检测瘤胃内产甲烷菌、原虫以及主要的纤维降解微 生物，并建立产甲烷菌活性检测手段。以产甲烷短杆菌属的模式菌种反刍 兽甲烷短杆菌( M e t h a n o b r e v i b a c t e rr u m i n a
3、n t i u m ) 为研究对象，建立实时定量P C R 绝对定量法。研究发现，荧光定量P C R 方法( y ) 与传统计数法( x ) 对产甲烷 菌的定量结果强相关，Y = 1 0 1 5 2 x 3 x 1 0 8 ( r = 0 9 7 5 3 ；P 0 7 m o l LN a C l ) ，C T A B 与蛋 4 l 第一二章瘤胃产甲烷菌及微生物菌群分子研究方法的建立 白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖， 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1 4 4 2 1 试剂 1 C T A B 提取缓冲液： 1 0 0m M “ I r i
4、 s H C l ( p H8 O ) 1 4M N a C l 2 0 m ME D T A ( 钠盐) 2 H e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mB r o m i d e ( C T A J 3 ) 1m o l LT r i s - H C l ( p H8 0 ) ：用8 0m l 去离子水溶解1 2 1l gT f i s 碱，加浓盐 酸调p H 值至8 0 。加水定容至1 0 0m l 。 2 0 0m m o l L E D T A ( 钠盐) ：用8 0m l 去离子水溶解2 9 乙二胺四乙酸二钠盐， 加水定容至
5、1 0 0m l 。 配制每升C T A B 提取缓冲液，需在8 0 0m l 去离子水中加入8 1 9 9N a C I ，2 0 9 溴化十六烷三甲基溴化铵，使之充分溶解，然后加入1 0 0m l1m o l L “ I r i s H C l ( p H 8 0 ) ，1 0 0m l2 0 0m m o l LE D T A ( 钠盐) ，加水定容至1 0 0 0 m l ，分装后高压灭菌。 2 酚氯仿 3 异丙醇 4 7 0 乙醇：取7 0 m l 无水乙醇，加水定容至1 0 0 m l 。 5 1 0 T E 缓冲液( p H8 0 ) ： 1 0 0m m o l L “ I r
6、 i s - H C I ( p H8 0 ) 1 0m m o l LE D T A ( p H8 0 ) 分装后高压蒸汽灭菌2 0 分钟，在室温保存。 1 4 422 仪器和设备 1 高通量型珠磨器( B i o S p e c ，U S A ) 2 1 0 0I t m 和5 0 01 t t m 粒径的锆珠( B i o S p e c ，U S A ) 3 加热器( R a t e kI n s t r u m e n t s ，A u s t r a l i a ) 4 涡旋器 5 M i c r o f u g e 2 2 R 型冷冻台式离心机( B e c k m a nC o
7、 u l t e r ，U S A ) 6 N a n o D r o pN D 一10 0 0 ( N a n o D r o pT e c h n o l o g i e s ，U S A ) 1 4 423 基因组D N A 提取步骤 1 在菌液沉淀中加入2 0 0m g 已灭菌的锆珠( 粒径1 0 0u m 和粒径5 0 0r t m ) 。加 入8 0 0 p 1C T A B 提取缓冲液，珠磨仪震荡2 分钟后，静置2 分钟，重复一次。 4 2 浙江大学博士学位论文瘤胃产叩烷菌定置检测与微生物茵群调控研究 2 在7 0 温育2 0 分钟，1 0 0 0 0g 离心1 0 分钟。 3
8、将上清吸入新的离心管，加入5 0 0u l 酚氯仿，涡旋形成白色乳浊液。 4 1 3 0 0 0r p m ，离心l O 分钟。 5 吸取5 0 0p 1 上层液体于新的离心管。 6 加入3 0 0 I t l 异丙醇，轻轻上下倒置离心管数次。 7 室温下静置5 到1 0 分钟使D N A 沉淀，1 3 0 0 0r p m ，离心1 5 分钟。 8 去上清，此时D N A 可见，呈灰色沉淀。 9 加入1m l7 0 乙醇，用手指轻弹管底，洗涤沉淀。 l O 在7 0 温育1 0 分钟，在温育期间用手指轻弹离心管洗涤沉淀，此时沉淀 变白且明显易见。 1 1 1 3 0 0 0r p m ，离心
9、1 0 分钟。 1 2 去上清，干燥沉淀( 在室温干燥或7 0 干燥5 分钟，避免过度干燥) 。 1 3 依据沉淀大小加入5 0 到l O O g lT E 重新悬浮沉淀，如果必要，加热促进溶解。 1 4 在N a n o D r o pN D 一10 0 0 上测定D N A 的纯度及浓度( O D 2 6 0 O D 2 3 0 的比值在 1 7 2 0 之间) ，2 0 保存待用。 1 4 4 3 实时荧光定量P C R 方法 1 4 4 3 1 仪器 实时定量P C R 反应采用A B IP R I S M7 9 0 0 H T 实时P C R 系统( A B I7 9 0 0 H T
10、 F a s tR e a lT u n eP C R S y s t e m ，A p p l i e dB i o s y s t e m s ，U S A ) ，见图2 6 。 实时定量P C R 反应的3 8 4 孔反应板的加样由B i o m e k 2 0 0 0 实验室全自动工 作站( B e c k m a nC o u l t e r ，U S A ) ( 图2 7 ) 完成。 图2 6A B IP R I S M7 9 0 0 H T 实时P C R 系统 F i g u r e2 6A B IP R I S M7 9 0 0 H TF a s tR e a lT i m
11、eP C RS y s t e m 第- 二章瘟胃产甲烷菌及微生物菌群分子研究方法的建立 图2 7B i o m e k 2 0 0 0 实验室全自动工作站 F i g u r e2 7B i o m e k 2 0 0 0L a b o r a t o r yA m o m a t i o nW o r k s t a t i o n 1 4 4 2 2 试剂与耗材 实时定量P C R 反应采用S Y B RG r e e n 染料法，荧光染料预混试剂为 P l a t i n u m S Y B R 。G r e e nq P C RS u p e r M i xU D Gw i t hR
12、 O X ( I n v i t r o g e n ，U S A ) 。 实时定量P C R 反应在3 8 4 孔板上进行，3 8 4 孔板为M i c r o A m p T MO p t i c a l 3 8 4 - W e l lR e a c t i o nP l a t ew i t hB a r c o d e ( A p p l i e dB i o s y s t e m s ，U S A ) 。3 8 4 孔板的封 膜为M i c r o A m p T M9 6 - & 3 8 4 - W e l IO p t i c a lA d h e s i v eF i l m
13、 ( A p p l i e dB i o s y S t e m s ， U S A ) 。 1 4 4 2 3 反应体系与扩增条件 实时定量P C R 反应终体系为1 0 山反应体系。反应体系的配制在无菌操净台 上进行，使用9 6 孔板先配制3 5p 1 反应体系母液。而后通过B i o m e k 2 0 0 0 实验 室全自动工作站( B e c k m a nC o u l t e r ，U S A ) 将母液自动分装到3 8 4 孔板，每孔 1 0 山，三个重复。 实时定量P C R 的扩增条件见图2 8 ：( 1 ) 5 0 ，2 分钟；( 2 ) 9 5 ，预变性 2 分钟：(
14、 3 ) 9 5 ，变性1 5 秒；6 0 ，复性和延伸1 分钟，；共4 0 个循环：( 4 ) 熔解曲线分析扩增产物的特异性，温度以1 “ C 3 0 s 的速度从6 0 上升9 5 。 表2 3 实时定颦P C R 反应母液配制表 1 a b l e2 3M a s t e rM i xf o rR e a lT i m eP C R 里! 堡箜里! 望堡 塑! 坚巴! ! 幽211 璺垒! 至旦翌呈! 里望箜1 2 里 2xS Y B R G r e e n 1 7 5Ix F o r w a r dP r i m e r ( 10 I t M ) R e v e r s eP r i
15、m e r ( 10 1 t M l H 2 0 ( S t e r i l e ) R 翼一墅曼一 T 0 t a IV b l u m e 1 0 5 1 0 5 1 2 4 3 0 0n M 3 0 0n M 曼t - 螋n 魄i 一 3 5 浙江大学博士学位论文 瘤胃产甲烷菌定量检测与微生物菌群调控研究 S t 卸e3 R e p e a t s ：4 0 9 50 9 5 0 卜 尹L D 图2 8R e a l T i m eP C R 热循环程序 F i g u r e2 8R e a l T i m eP C RT h e r m a lC y c l eP r o g r a
16、 m 1 4 425R e a lt i m eP C R 产物检测 1 4 4 2 5 1 试剂与耗材 1 电泳缓冲液：0 5 T B E ( T r i s B o r a t e E D T A ) 缓冲液 2 E t B r 3 G e n e R u l e rL a d d e rM i x ( F e r m e n t a s ，U K ) 4 6 L o a d i n gB u f f e r 1 4 4 2 5 2 仪器和设备 1 电泳仪：B i o R a dM i n iS u b 刑C e l l 缓冲槽。 2 B i o R a dG e lD o c2 0 0 0 凝胶成像系统( B
