酶学分析技术2016年

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1、第五章,酶学分析技术,1,2,简介内容：,一、酶的基础知识 二、酶含量的表示方法 三、酶促反应动力学 四、酶促反应进程,第一节 酶学分析技术基本知识,3,一、酶的基础知识,4,高效性、高度特异性、高度不稳定性、可调节性,酶的应用：,酶（enzyme）：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂,酶的催化特点：,酶活性/含量的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断。,酶的组成和命名,由于酶的特异性强，催化反应的速度快，反应条件温和等，因此酶试剂一般化学试剂，具有更高的特异性和灵敏度，更易于自动化，可为临床更加及时地提供准确的检验信息。,胰蛋白水解酶,5,

2、二、酶含量的表示方法,酶测定标本及方法类型,标本： 组织细胞 体液：以血浆或血清为主 测定方法： 酶质量测定：绝对质量，以g/L为表示单位 酶活性测定：相对质量，以U/L为表示单位,7,(一)、酶活性浓度表示方法,酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。,表示方法：,或,式中v：反应速率，P ：产物浓度，t：时间，S：底物浓度。,8,酶活性单位,定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。,表示方法：,惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 国际单位IU（

3、mol/min） Katal单位（mol/s）,9,1惯用单位：,20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位,ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）,特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。,卡门氏单位：1.0ml血清在25，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4mol NADH为一个卡门氏单位,举例：,金氏单位：100ml血清ALP在37与底物作用15min，产生1mg酚。,10,2.国际单位IU（mol/mi

4、n）,定义：在规定条件下（25及其他最适条件），每min催化1mol 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1mol/min。,IFCC,2001年 37,3Katal单位,定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal1mol/s。,IU与Katal单位的关系：1katal = 60106IU，1IU = 16.67nkatal,国际单位IU 25,单位U 37,11,酶活性浓度,酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.,计算公式:

5、,产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml）,分光光度法测定的公式：,（A测定 A对照）V总106 每单位规定的保温时间 酶单位/升 = LV标 实际保温时间,正常上限升高倍数（ULN）,概念：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上限所得倍数。 即ULN,酶活性实测值,正常参考范围上限,例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常参考范围上限为40mmol/L，其ULN80/402,原理：用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位报告结果。如ng/ml或g/L等。 优点： 1、灵敏度高； 2

6、、特异性高 3、无活性酶蛋白测定 4、适于同工酶测定 不足： 1、抗体难以制备；2、方法繁杂；3、测定成本高,(二)、酶质量浓度表示方法,15,三、酶促反应动力学,16,研究内容：(初速度,单因素),研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学 。,指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性 或代谢物浓度。,研究意义:,(一)、酶促反应机制,E + S ES E + P,米-曼氏方程(数学表达式),v = ,v 代表反应速度 Vmax 代表最大反应速度 S 代表底物浓度 Km 米氏

7、常数,Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价值。,VmaxS,S+ Km,19,Km的含义:,当Km=S时， ，可见Km值等于反应速率达 到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。,Km的意义：,Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关 鉴别酶的种类 反映酶对底物亲和力的大小 选择酶的最适底物或天然底物 设计适宜的底物浓度,20,Vmax的含义,定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。,应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。,计算公式为：,(单位是s

8、-1),计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）,TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）,= Vmax / E,（二）、Km与Vmax的应用,2.鉴定酶的种类,Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。,1. Km的计算,表.某些酶的Km值,酶 底物 Km(mmol/L),乳酸脱氢酶 丙酮酸 0.017 己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5 -半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0 碳酸酐酶 H2CO3 9.0 过氧化氢酶 H2O2 25 蔗糖酶

9、 蔗糖 28 糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108,3.反映酶与底物的亲合力,Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。,4.选择酶的最适底物,当酶可有几种底物时，其Km值最小者，为该酶的最适底物。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物。,5.设计适宜的底物浓度,酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的92%左右，当S在1020km是，反应初速度可达90%95%Vmax。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。,6. Vmax可用于酶的转化率的计算,25,四、酶促反应进程,26,以产物生成量（或反应物减少量）为

10、纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）,27,（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）,特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟,t1 t2 时间t 图5-1 酶促反应进程曲线,吸光度A,线性期,非线性期,R1,R2,延滞期,孵育期,延滞期,28,（二）线性期,特点：可代表酶促反应速度,最大反应速度期，是测 定酶活性最佳时期，持续时间15min。此期反应速度与底物浓度无关，而与酶活性成正比。,线性期（零级反应期）：,概念：酶促反应速度达到最大并保持恒定速度进行反应的时期,29,（三）非线性期（偏离线性期、

11、平坦期 ）,进入非线性期的原因：,反应的不断进行，底物消耗越来越多，可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。,特点：,若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度S的一次方 成正比，为一级反应。,30,酶学分析技术的应用,第二节 酶活性测定方法,第三节 代谢物酶学分析技术,31,酶测定,绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法,E,E,第二节 酶活性测定方法,32,一、定时法,原理： 定时法是固定时间法的简称，是指底物与酶反应一段时间（t1t2）后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应,测定这段时间内产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性

12、的方法。,特点： 优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。,二、连续监测法,原理： 连续监测法是指在酶促反应的线性期每间隔一定时间测定一次产物或底物的变化量,根据其变化量间接求出酶活性浓度，因是测定产物或底物随时间的变化量又称速率法。,概 念,与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 标本和试

13、剂用量少，可在短时间内完成测定； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 。,特 点,无需停止酶促反应,不需添加其他呈色试剂,在线性期测定酶活性,标本和试剂用量少,可在短时间内完成测定,连续观测反应进程,对仪器要求高,（一）直接法,指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。,测定NAD（P）H的方法 测定人工合成的色素原底物的方法 测定耗氧量的方法 测定pH改变的方法

14、 等,连续监测法的分类,1测定NAD（P）H的方法 原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。 对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例如LD、G-6-PD、GLDH等 。,38,2测定人工合成的色素原底物的方法,原理： 一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团被水解或转移，使无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原底物。根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后测定酶活性。,底物和测定对象：,39,（二）间接法,一步间接法 酶偶联法,是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或

15、 底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。,在反应体系中加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性的试剂，这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化,（三）酶活性浓度的计算,摩尔消光系数()：在特定条件下，当吸光物质的浓度为1 mol/L，吸收池厚为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值A。,意义：值取决于入射光的波长和吸光物质的吸光特性，亦受溶剂和温度的影响。显然，显色反应产物的值愈大，基于该显色反应的光度测定法的灵敏度就愈高。,在测酶时，常数K值的选择是很重要的。此值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，K值愈大,41,代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物浓度的技术。,酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。,第三节 代谢物酶法