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1、中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院 硕士学位论文 甲鱼油的提取与分析及其生物学活性研究 姓名：白晶 申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学 指导教师：田亚平 20070516 军医进修学院硕士学位论文 m - 3P U F A s ( e - 3p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d )m - 3 多不饱和脂肪酸 亚麻酸 二十二碳六烯酸 超临界C 0 2 萃取 气相色谱 P C N A ( p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n )增殖细胞核抗原 H
2、 E ( h e m a t i n e - e o s i n ) 环氧化酶2 甲基噻唑基四唑 最小抑菌浓度 最小杀菌浓度 苏木精伊红 T 1 D M ( t y p e Id i a b e t e sm e l l i t u s )I 型糖尿病 T 2 D M ( t y p e I Id i a b e t e sm e U i t u s )型糖尿病 I R ( i n s u U nr e s i s t a n t ) D M E M ( d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e 。Sm e d i u m ) 胰岛素抵抗 达尔伯克(
3、氏) 改良伊 格尔( 氏) 培养基 P M S F ( p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l i l u o r i d e ) 苯甲基磺酰氟化物 H E P E S ( h y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i ca c i d ) 羟乙基哌嗪乙磺酸 2 , 5 二苯嗯唑 P O P O P Q a 珀- p h e l l y 】e n e p h e n y l o x a z o l e ) 对苯撑苯嚼唑 军医进修学院硬士学位论文 缩写( 英文全称)中文
4、全称 D M S O ( d i m e t h y | s u l p h o x i d e ) E D T A ( e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ) P B S ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n ) I L 一1 B ( i n t m l e u k i nl a ) T N F a ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a ) N F - d B ( u c l e a
5、rf a c t o r - k a p p aB 1 B C A ( b i c i n c h o n i n i ca c i d ) 二甲基亚砜 乙二胺四乙酸 磷酸盐缓冲液 白介素1 B 肿瘤坏死因子- C t 核因子r B 二喹啉甲酸 4 军医进修学院硕士学位论文 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风，本人声明：所呈交的论 文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已 经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证 书而使用过的材料
6、，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：刍铀 指导教师签名 日期：一7 ，t 。形 日期：如7 、s f 6 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医 进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文 以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除 外) 。 仫形 卜t 7 7 跏抄 骺期 粕锄西比 名名签签 者师作教
7、 文导 论指 军医进修学院硬士学位论文 甲鱼油的提取与分析及其生物学活性研究 中文摘要 目的：为从甲鱼脂肪中提取甲鱼油，富集其中的e o - 3P U F A s ，并分别从 细胞水平和实验动物整体水平探讨其生物活性，即分别研究c o - 3P U F A s 对胰 岛素抵抗H e p G ：细胞胰岛素敏感性及糖代谢和大鼠浅度烧伤创面愈合的影 响 方法：实验一：采用超临界c O t 萃取方法从甲鱼脂肪中提取甲鱼油，然 后利用低温浓缩法富集甲鱼油中的c o - 3P U F A s ，最后利用G c 法测定甲鱼油中 的一3P U F A s 的含量实验二：利用高浓度胰岛素体外诱导方法建立H c
8、p G ， 胰岛素抵抗细胞模型，通过3 H D _ 葡萄糖参入实验鉴定该细胞模型采用M T T 方法检测细胞的增殖情况利用甲鱼油处理模型细胞通过葡萄糖氧化酶及 3 H D _ 葡萄糖参入实验分别检测其葡萄糖消耗和3 H _ D - 葡萄糖参入率。实验三： 将甲鱼油作用于正常大鼠皮肤表面，进行皮肤刺激试验和致敏试验利用琼 脂扩散法，通过测定金葡茵，绿脓杆茵，大肠杆菌及白色念球菌等四组的抑 茵圈，判断甲鱼油对致病菌的体外抑茵效果同时用稀释法测定甲鱼油的最 低抑茵浓度M I C 与最低杀菌浓度M B C 。将甲鱼油应用于大鼠浅度烧伤创面， 判断其对创面愈合及组织修复的影响取1 0 8 只# i s
9、t a r 大鼠随机分为单纯烧 伤组、银辛霜治疗组和甲鱼油治疗组，每组3 6 只建立浅度烫伤大鼠模型， 备组创面分别用银辛霜纱布，甲鱼油纱布，生理盐水纱布覆盖包扎固定各 组动物分别于伤后1 ，3 ，5 ，1 0 ，1 4 夭取创面组织，根据苏木精咿红染色( 腿) 结果，病理组织学变化及通过免疫组织化学链霉素一卵白素一生物素一过氧化物 酶复合物法检测的创面组织增殖细胞核抗原表达情况判断创面愈合率及愈合 时间 结果：1 从经低温干燥脱水处理的甲鱼脂肪中提取甲鱼油，得油率8 2 O 经优化的萃取实验参数为：萃取压力2 0 M P A ，分离压力8 M P A ，萃取温度5 0 ， 分离温度为3 5
10、，C O ：流量为2 m l g 低温浓缩法富集甲鱼油中的c o - 3P U F A s 的最佳条件为温度一5 0 原料：溶剂比为1 ：1 2 、冷冻时间8 h ，获得的一3 P U F A s 含量最高( 2 6 3 9 j 1 ) 2 高浓度胰岛素细胞的葡萄糖参入率在各种浓度 7 军医进修学院硕士学位论文 的胰岛素刺激下均低于对照细胞( 尸 - 6 0 ；而且，随丙酮用量加大，富集E P A + D H A 含量先有增高 的趋势，但当增加到l ：1 6 溶剂配比的富集试验，E P A + D H A 含量并未增高。 以上结果表明，5 0 、原料：溶剂比为1 ：1 2 、冷冻8 h ，获得
11、的E P A + D H A 含量最高。 讨论 本研究采用超临界C 0 2 萃取方法从甲鱼脂肪中提取甲鱼油，然后利用 低温浓缩法富集甲鱼油中的洳3P U F A s ，最后利用G C 法测定甲鱼油中的 m - 3P U F A s 的含量。在萃取前首先对甲鱼脂肪进行低温冷冻干燥，其主要 原因是萃取率除了与所选温度压力有关外，还与脂肪的含水量有关。脂肪 中的水含量对萃取是多方面的，水分含量不仅影响其萃取速率和效率，而 且还影响分离条件的选择以及超临界萃取设备的的正常运转，因此在萃取 前需对甲鱼脂肪进行低温干燥脱水处理。其中，临界C 0 2 从甲鱼脂肪中萃 取E P A 、D H A 的最优化工艺
12、条件分别为：A l B 3 C 3 ，E P A 和D H A 的最高萃 取率为：1 6 3 2 。其最优化工艺条件是：压力2 0 M P A ，温度5 0 ；时间4 小时，C 0 2 用量为2 m l g 。盐溶解度法、尿素包和法、吸附分离法、分子蒸 馏法和超临界流体萃取6 类方法，均存在不足，低温结晶法需大量单一有 机溶剂，并需将粗油酯化，步骤繁多，需2 种以上大量有机溶剂；尿包合 法需先酯化处理，包合步骤较复杂，尿素不易去除，并且包合中可形成致 癌物氨基甲酸乙酯( c a r c i n o g e n e t h lc a r b a m a t e ) ；吸附分离法中的洗脱剂易 增加
13、污染，不宜大规模制备；分子蒸馏法存在高温、长时间，不能解决多 烯酸氧化、分解等问题；超临界流体萃取法难以将双键数相近的脂肪酸； 2 1 军医进修学院硕士学位论文 因此，单一富集方法的效果均不理想 3 2 - 3 5 。本研究为避免E P A + D H A 在纯 化过程中受氧、光、热的作用而发生氧化、聚合、异构化等反应，选用超 临界萃取和低温直接富集原油中E P A + D H A 的工艺，取得较好结果。其优 点在于，超临界萃取以C 0 2 溶剂，在常温条件下进行，无加热过程中的氧 化分解、无溶剂污染，工艺简单、工期短、获取的高质量原油可直接进行 低温富集，E P A + D H A 在低温环
14、境中无氧化，分解，异构化，浓缩的 E P A + D H A 无异味、对人体和环境无害、其副产品还可充分利用。 低温浓缩法主要是根据低温条件下凝固点的差异进行的，从G C 结果 看，5 0 ，可去处大部分饱和脂肪酸；从沉淀样品的G C 结果看，其趋势 是饱和脂肪酸和单烯脂肪酸增高，多烯脂肪酸降低，但低温也使E P A + D H A 产生共沉淀作用，不易完全被分离出来，沉淀中仍留有多烯脂酸，今后应 考虑将这部分必需脂肪酸有效地提取出来。通过对不同温度、不同溶剂配 比操作条件的摸索，认为，5 0 、原料：溶剂比为1 ：1 2 、冷冻8 h 的条件 下，获得的E P A + D H A 含量较高。
15、 超临界C 0 2 萃取法比溶剂法优越，具有萃取率高，不破坏多烯不饱和 脂肪酸、无溶剂残留、产品口味佳，质量好、不危害环境等优点。同时所 用c 0 2 流体性质稳定、安全、操作方便，能耗低、价格便宜。临界C 0 2 物理萃取和低温技术相结合的现代工艺提取并富集E P A + D H A ，工艺简便、 工期短，浓缩的产品适于药品和营养品的要求，提高了医药价值。甲鱼可 以通过简单生长营养素的培养，使其生长周期短，收获快，而且还可以通 过生物工程方法和培养条件来提高D H A 和E P A 的含量。作为一种新的原 料来源具有和大潜力。为今后大力开发和综合利用海洋资源，探讨了新的 工艺路线，开辟了新的
16、应用途径，具有很好的发展应用前景。 军医进修学院硬士学位论文 第二部分甲鱼油对胰岛素抵抗H e p G 2 细胞 胰岛素敏感性和糖代谢的影响 近年来，通过研究表明3P U F A s 对糖尿病有着重要的影响。糖尿病是 世界公认的危害人类健康的三大主要疾病之一，其发病率与日俱增。糖尿病 可分为I 型糖尿病( t y p eld i a b e t e sm e l l i t u s ，T 1 D M ) 和I I 型糖尿病( t y p e2 d i a b e t e sm e l l i t u s ，1 如M ) ，目前调查发现患者中约9 0 左右为T 2 D M 。T 2 D M 特点是同时出现胰岛素抵抗( i n s l l l i n r e s i s t a n t , I R ) 和胰岛素分泌缺陷。胰岛素抵 抗O R ) 是指胰岛素作用的外周组织主要是肝脏、脂肪组织和骨骼肌对它的敏 感性和反应性降低，即机体对正常量的胰岛素反应性减
