《甲鱼VB17检测及VB17与β葡萄糖苷酶联合应用的抗肝癌作用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甲鱼VB17检测及VB17与β葡萄糖苷酶联合应用的抗肝癌作用研究（70页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、甲鱼V B l 7 检测及V B l 7 与p 葡萄糖苷酶联合应用 的抗肝癌作用研究 研究生：张晓旭 导师：赵国琦教授 钱利纯副研究员 ( 扬州大学动物科学与技术学院，2 2 5 0 0 9 ) 摘要 本试验采用超声波乙醇浸提法从甲鱼体内粗提V B l 7 ，利用H P L C 法 对提取液进行定性、定量分析；同时通过体内外试验研究V B l 7 被B - 葡萄 糖苷酶激活的抗肝癌效果，探讨了V B l 7 的抗肝癌机制，为甲鱼抗癌保健 品的开发提供研究思路及理论依据。 l 、利用H P L C 法对甲鱼浸提液进行定性、定量分析。结果表明，在 乙醇浓度为9 0 ，料液比1 ：1 5 ，超声波温
2、度2 0 。C ，超声时间3 0 m i n 的 条件下，甲鱼体V B l 7 的含量可达1 0 4 6 m g k g 。 2 、体外培养人肝癌H e p G 2 细胞，观测V B l 7 与1 3 葡萄糖苷酶联合应 用诱导细胞凋亡的作用。M T r 法检测发现V B l 7 与0 。葡萄糖苷酶联合应 用的效果要明显的优于V B l 7 单独作用，随着药物浓度的增加和作用时间 的延长，其对H e p G 2 细胞增殖的抑制率增加；显微镜下观察发现随着药 物浓度的增加和作用时间的延长，细胞开始变圆、皱缩，贴壁细胞的数量 越来越少，1 4 m g m L 组细胞己呈现出典型的坏死状；A O E
3、B 荧光染色法 观察表明凋亡细胞数随着V B l 7 浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增 多，各实验组的细胞凋亡率与对照组相比差异极显著( 氏O 0 1 ) ；A n n e x i n V - F I T C P I 双染流式细胞术分析结果显示细胞凋亡率随V B l 7 浓度增加和 作用时间的延长而逐渐增高，V B l 7 添加组的细胞凋亡率与对照组间，存 在极显著差异( P 振荡时间 超声时间 提取液浓度，确定从杏仁花粉中浸提苦杏 仁苷的的最佳工艺条件为1 0 0 的乙醇、料液比1 ：7 、超声时间2 0 m i n 、振荡提取 扬州大学硕士学位论文 1 2 h 。杨晓君等【8 9 J 也
4、优化了新疆苦巴旦杏中的V B l 7 的提取工艺，确定了最佳的灭酶 时间、杏粉和石油醚比例以及脱脂粕和乙醇比例。目前尚未见到从动物中提取V B l 7 的报道，本试验参照植物中提取的工艺，采用超声波乙醇浸提法从甲鱼体浸提得到 V B l 7 ，这与伍慧生1 2 之前的报道相一致。 从色谱图上我们可以看到，参照植物体V B l 7 得提取方法，所得的甲鱼浸提液 中有很多杂峰，即浸提液中含有很多其他的成分，要分离纯化还有一定的困难。同 时利用本试验方法提取，对于浸提溶剂、提取时间、浸提次数和温度等单因素条件 还有待于进一步的优化，对于粗提所得的V B 。7 ，由于动物体内其它物质的影响浸提 液中所
5、含的杂质很多，纯化还有一定的难度。所以在下面所进行的体内外抗肝癌机 制的研究中，应用V B l 7 标准品来进行。 4 小结 本试验采用超声波乙醇浸提法对甲鱼体V B l 7 进行粗提，在乙醇浓度为9 0 ， 料液比l ：1 5 ，超声波温度2 0 “ C ，超声时间3 0 m i n 的条件下，测得每千克鲜活甲鱼 体内含有1 0 4 6 m g V B l 7 。 塑堕塑! ! 鱼璺，塑型壁鱼，与p - 笪堕塑童堕隧全堡旦堕垫墅堕堡旦婴窒 一旦 试验二V B l 7 与p 葡萄糖苷酶联合应用的体外抗肝癌 作用研究 V B l 7 本身的毒性很低，但被p 一葡萄糖苷酶特异性激活后，会产生氢氰酸
6、，引起 细胞呼吸抑制，导致细胞死亡【删。对于V B l 7 的抗肿瘤作用，在学术界一直存有争议， 一部分学者认为肿瘤细胞内无氧降解占优势，最终产物为乳酸，偏酸性环境有利于 提高B 葡萄糖苷酶的活性，促使V B l 7 在肿瘤细胞中分解出较多的苯甲醛和氢氰酸， 而产生对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，对健康组织不会产生很大的影响。车文一【3 3 】 报道，V B 】7 对子宫颈癌细胞株H C 2 6 的抑制率可达5 0 “ - 7 0 。与此相反的观点却认为， V B l 7 根本不是维生素，也没有抗癌作用，甚至还是有毒物质。1 9 世纪5 0 年代开始， 体外细胞试验因其稳定性、方便性和经济性的特点
7、被广泛用作药效检测和细胞毒性 的研究。近二十年来，体外培养细胞用于抗肿瘤实验的研究已被广泛应用，特别是 对中药复方的研究【9 卜9 2 】。 本试验以体外培养的人肝癌H e p G 2 细胞系作为研究对象，应用M T T 染色、 A O E B 荧光显微镜拍照和A n n e x i nV - F I T C P I 双染流式细胞术等方法，研究B 葡萄糖 苷酶和V B l 7 联合应用对H e p G 2 细胞增殖的影响，探讨V B l 7 抗肝癌的作用机理，也为 甲鱼的进一步开发应用提供试验依据。 1 材料和方法 1 1 试验材料 1 1 1 细胞株 人肝癌H e p G 2 细胞株：购自中
8、科院( 上海) 细胞库。 1 1 2 试剂和药品 R P M l l 6 4 0 培养基，胰蛋白酶，胎牛血清( F e t a lb o v i n es e r u l T l ，F B S ) ，二甲基 亚砜( D M S O ) 为美国G i b c o 公司产品；青链霉素，L - 谷氨酰氨( L g l u t a m i n e ，L - G l n ) 为A m r e s c o 产品；V B l 7 分析纯( 9 7 ) ，S i g m a 公司产品；B 一葡萄糖苷酶( 1 3 - G l u e o s i d a s e ， 活。 生3 7 U m g 粉末) 日本株式会
9、社产品；M T T 试剂盒、A O E B 染色试剂盒购自南京 扬州大学硕士学位论文 凯基生物科技发展有限公司；A n n e x i nV - F I T C P I 双染试剂盒购自碧云天生物技术研 究所。 1 1 3 培养用液及药液 R P M l l 6 4 0 培养基添加1 0 的F B S 、2 m m o l LG I n 、2 3 8 m g m LH e p e s 、1 0 0 U m L 青霉素、1 0 0 p g m L 链霉素；磷酸缓冲溶液( P h o s p h a t eB u f f e r e dS a l i n e ，P B S ) ； V B l 7 溶
10、液：用不含血清的R P M l l 6 4 0 培养基溶解，配制成1 4 0 m g m L 的母液，0 2 2 p m 微孑L 滤器除菌，4 保存，试验时根据需要用非完全培养基稀释至所需浓度。 D 一葡萄糖苷酶溶液：用不含血清的1 6 4 0 培养基溶解，配制成l m g m L 的母液，0 2 2 t x m 微孔滤器除菌，根据需要用非完全培养基稀释至所需浓度，现配现用。 1 1 4 培养仪器和用具 V S 1 3 0 0 U 超净工作台( 苏州净化设备厂) 、T E 2 0 0 0 u N 置荧光显微镜( 日本 N i k o n 公司) 、H e r a e u sB B l 6 U
11、VC 0 2 培养箱( 德国H e r a e u s 公司) 、S p e c t r a M a xM 5 全波段酶标仪( 美国M o l e c u l a rD e v i c e s ( M D ) 公司) 、M V S 1 漩涡混合器( 北京金 紫先科发展有限公司) 、C y t o m i c sF C 5 0 0 流式细胞仪( 美I N B e c k m a n 公司) 、J A 2 0 0 3 电子天平( 上海精密科学仪器有限公司) 、5 8 0 4 R 氐温离心机( 德N I E p p e n d o r f 公司) 、 超低温冰箱( 日本S A N Y O 公司) 、
12、光学显微镜( 日本O L Y M P U S 公司生产) 。 1 2 试验方法 1 2 1 细胞培养、冻存、复苏 1 2 1 1 细胞培养 人肝癌H e p G 2 细胞用含体积分数1 0 的F B S 的R P M I - 1 6 4 0 培养液培养于3 7 ，5 C 0 2 培养箱培养中。待细胞长至单层，倒除原培养基，无菌P B S 洗涤两次 后，用O 2 5 胰酶+ O 0 2 E D T Al m L 消化细胞，置显微镜下观察，待细胞变圆时， 立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶。倒掉消化液，加入完全培养基终止消化，用巴 氏德吸管轻轻吹打，制成单细胞悬液，以适当细胞密度分装入几个培养瓶中，补
13、加 完全培养基，放入培养箱中培养。 张晓旭：甲鱼V B 。，检测及V B t ，与p 葡璃i ! 宣梦酶联鱼堕旦堕垫墅堕堡旦堕窒旦 1 2 1 2 细胞冻存 当细胞铺满培养瓶底部时，倒掉培养液，用P B S 洗涤细胞两次，在每个2 5 c m z 的培养瓶加入l m0 2 5 胰酶+ O 0 2 E D T Al m L 消化细胞，在显微镜下观察，待细胞 开始变圆，立即停止消化。倒掉消化液，加入完全培养基终止消化，用巴氏德吸管 轻轻吹打，制成单细胞悬液1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清液，加入不含血清的培养 基再次洗涤细胞，以完全洗净消化液。收集细胞加入冻存液( 由7 份未3 r
14、 i d , 牛血清 的R P M I l6 4 0 培养基+ 2 份胎牛血清+ 1 份D M S O 混合而成) l m L ，轻轻混匀后转 入冻存管，标记细胞种类和日期，4 “ C 放置3 0 分钟，2 0 放置1 小时，然后快速放 入7 0 冰箱过夜，最后保存到液氮中。 1 2 1 3 细胞复苏 将冻存管取出后迅速放入3 7 “ C 水浴中不断摇晃使其1 分钟内融化，将管内液体 移入离心管，快速加入R P M l l6 4 0 完全培养基6 m L ，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃去上 清，再加入适量R P M l l 6 4 0 完全培养基，混匀，移入培养瓶，置3 7 “
15、 C ，5 C 0 2 培 养箱培养，当细胞长满瓶底的8 0 时用于试验。 1 2 2 药物浓度的选择 将p 一葡萄糖苷酶的终浓度定为0 1 m g m L ，首先按照M 订预试验从低浓度到高 浓度筛选出与0 1 m g m L1 3 葡萄糖苷酶联合应用4 8 h 对细胞的生长抑制率为5 0 左 右的V B l 7 浓度( 3 5 m g m L ) ，以该浓度为基础，设计本试验V B l 7 为1 7 5 m g m L 、 3 5 m g m L 、7 m g m L 、1 4 m g m L 四个浓度梯度。 1 2 3V B l 7 对H e p G 2 细胞增殖的影响 1 2 3 1V
16、 B l 7 单独应用对H e p G 2 细胞增殖的影响 试验分组：( 1 ) 调零组，( 2 ) 对照组，( 3 ) 试验I 组( 终浓度：1 7 5 m g m L V B l 7 ) ， ( 4 ) 试验I I 组( 终浓度：3 5 m g m L V Bx 7 ) ，( 5 ) 试验组( 终浓度：7 m g m L V B l 7 ) ， ( 6 ) 试验组( 终浓度：1 4 m g m L V B l 7 ) 。 调零组和对照组添加2 0 p 1 非完全培养基：试验组每孑L J 3 H 2 0 9 l V B l 7 ，终浓度为 扬州大学硕士学位论文 1 7 5 m g m L ，3 5 m g m L ，7 m g m L ，1 4 m g m L 。 试验步骤： ( 1 ) 取对数生长期的H e p G 2 细胞显微镜下计数，用
