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1、华中农业大学 博士学位论文 甘蓝型油菜基因组中开花期QTL的检测和分析 姓名：龙艳 申请学位级别：博士 专业：发育生物学 指导教师：孟金陵;赵建伟 20071201 摘要 摘要 开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的标志之一，决定着植物的有性生 殖。适时开花以避开不利外界环境，是植物得以繁衍的前提，也是决定作物能否获 得丰收的优良农艺性状。植物的开花是由多基因所控制的各种生理生化代谢途径所 决定的，是复杂的数量性状，同时也受各种外界环境因素的调节，其中温度和光照 是关键的环境因子。油菜是重要的油料作物，根据开花是否需要低温春化，分为冬 油菜和春油菜两种类型。人们对油菜开花的机制知之甚少，对决
2、定油菜冬、春性分 化的机制更不得而知。 甘蓝型冬油菜品种T a p i d o r 和半冬性油菜品种N i n g y o u 7 对低温春化需求不同。 本实验室以这两个品种为亲本构建了T ND H 群体并在9 个冬油菜环境下种植了该群 体。实验室还在T ND H 群体基础上衍生了R C F 2 群体。本论文报告了用T ND H 群 体做的两年春油菜开花试验，分析整理了D H 群体和R C F 2 群体多年多点共1 3 个冬 油菜实验的开花期数据；用1 0 0 个M S A F L P 分子标记参与构建了含3 5 2 个标记的 初级的T N 遗传连锁图，在此基础上整合了2 3 0 个S S R
3、 标记，构建了含6 2 1 个标记 的高密度T N 遗传连锁图；利用高密度图谱上2 2 9 个有D N A 序列信息的标记与拟南 芥基因组进行了电子比对作图( i ns i l i c om a p p i n g ) ，在T N 遗传图谱上定位了4 0 个 共线性区段和8 4 个保守岛；然后采用Q T L 分析软件、矾n Q T I c a r t 2 5 、Q T L m a p p e r 2 0 进行油菜开花期Q 1 1 L 及互作位点的检测和遗传效应分析，目的是在基因组水平上构 建甘蓝型油菜开花性状的基因网络图。 研究结果表明，在所有冬油菜环境中群体植株的开花期均表现超亲分离，证实
4、T ND N 群体的开花期为数量性状。为了充分揭示数量性状的多基因特征，本文不仅 综合分析了两个群体1 3 个冬、春油菜环境中在显著水平上( P = O 0 5 ) 检测出的开 花期Q T L ( 称为显著水平Q T L ，s i g n i f i c a n tl e v e lQ 凡S L 厂Q T L ) ，还将效应较小、显 著性程度较低( O 5 3 0 的标记，且各连锁群上标记的基本顺序和已发表的包含3 5 2 个标记的T ND H 群体骨 架连锁图谱( 邱丹，2 0 0 6 ) 基本保持一致。在基本骨架图的基础上，将分群时能分 到各个连锁群但没有包含在骨架图中的剩余标记按照一定的
5、标准逐一添加到各连锁 群上：若标记添加后，骨架图上的标记顺序在新构建的连锁群上不变，则该标记包 含到连锁群中，连锁图中所取的连锁群即为添加标记后的连锁群：若添加标记后骨 架图上标记顺序发生变化，则去掉该标记，连锁图中所包含的连锁群仍采用添加标 记前的顺序。 2 2 7 开花期基本数据分析 采用方差分析( A N O V A ) 来检测基因型效应( G e n o t y p e ) 、环境效应 ( E n v i r o n m e n t ) 、以及环境和基因型互作效应( G e n o t y p e E n v i r o n m e n t ) 对T ND H 群体和R C 1 ：2
6、群体开花期的影响。由于在各个环境中的重复数并不相等，方差分析 采用S A S 8 0 软件( S A SI n s t i t u t e ，1 9 9 9 ) 中的G L M 模型进行。群体的基因型、环境 效应，环境和基因型互作效应，以及单环境中的重复数( R e p l i c a t e s ) 均被当作随机 效应。将两个群体中分别计算出来的这四个统计量用来计算开花期性状的遗传力 ( 旷) ，遗传力计算按照H a l l a u e r 和M i r a n d a ( 1 9 8 8 ) 提出的公式进行。 2 2 8Q T L 分析 Q T L 分析采用的软件为Q T L c a r
7、t g r a p h e r 2 5 ( Z e n g ，1 9 9 4 ；W a n g ，2 0 0 6 ； h t t p ： s t a t g e n n c s u e d u Q T L c a r t W Q T L C a r t h t m ) 。O T L 定位采用该软件中的复合区间 作图法( C l M ) 进行。以P = 0 0 5 为概率，分别对每个环境的表型数据用1 0 0 0 次排 布测验方法( p e r m u t a t i o nt e s t ，C h u r c h i l la n dD o e r g e1 9 9 4 ) 来确定L O D
8、值的阈值。对 于不同环境检测到的Q T L ，当它们的置信区间( c o n f i d e n c ei n t e r v a l ，2 - L O D ) 重叠时， 在统计时认为为同一个Q T L 。统计不同环境中检测到的达到闽值以上的Q T L ，并将 它们命名为显著水平的Q T L ( S L - Q T L , S i g n i f i c a n tl e v e lQ T L ) 。同时统计不同环境中 甘蓝型油菜基因组中开花期Q T L 榆测和分析 L O D 值处于P - 0 5 水平和P = 0 0 5 水平之间的位点，即L O D ( P = O 0 5 ) L O D
9、 = L O D ( P = 0 5 ) ( D H 群体或R C F 2 群体) ，在所有环境中能重复出现2 次或以上的，将其 称为真实存在的微效Q T L ( M R Q T L , M i c r o r e a lQ T L ) 。 Q T L c a r t g r a p h e r 2 5 软件中的多性状联合分析法( M T M ) 用来分析T ND H 群体 中开花期Q T L 与环境的互作。也以P = 0 0 5 为概率，采用排布测验的方法( D o e r g ea n d C h u r c h i l l ，1 9 9 6 ) 来判定Q 1 1 L 与环境存在互作的阈值
10、。 2 2 9 遗传效应和遗传位点互作分析 所有环境中开花期的遗传效应( 包括单位点遗传效应和两位点遗传效应) 分析 采用软件 Q T L m a p p e r 2 0 (Z h ue t a 1 ，1 9 9 5 ； h t t p ：w w w c a b z j u e d u c n i c s f a c u l t y z h u j u n h t m ) 进行，该软件采用混合线性模型。 同时各个单环境点中互作位点的分析也采用该软件进行。以P = 0 0 0 5 为标准，当概 率小于或等于0 0 0 5 时即认为基因组两位点间可能存在着互作关系。互作位点的显 著性通过软件中的贝
11、叶斯方法( B a y e s i a nt e s t ，P = 0 0 0 5 ) 进一步检测。 2 2 1 0 抽薹期、现蕾期和开花期条件Q T L 分析 在分析抽薹期、现蕾期对开花期的影响时，分别以抽薹期和现蕾期为条件性状， 开花期为被条件性状，采用G e n a e x e 和G e n c o n d l e x e 程序( Z h ue ta 1 ，1 9 9 5 ； h t t p ：w w w c a b z j u e d u c n i c s f a c u l t y z h u j u n h t m ) 生成开花期被条件后的数据。将条 件后数据用Q T I _ c
12、 a r t g r a p h e r 2 5 进行Q T L 扫描。采用同样的方法分析抽薹期对现蕾 期的影响。再比较同一个性状如开花期被条件前后Q T L 的变化情况。 2 2 1 1Q T L 区间和互作位点对应候选基因分析 2 2 1 1 1T N 遗传图谱与拟南芥比较作图 T N 遗传图谱与拟南芥比较作图时以拟南芥的2 1 个保守区段为基础( P a r k i ne t a 1 ，2 0 0 5 ) 。将遗传图谱中已知序列信息的标记作为锚定标记，将它们的引物序列或 扩增序列和拟南芥基因组数据库中序列进行比对，用以确定这些标记在拟南芥上对 应的物理位置。这些标记的物理位置用以界定T
13、N 遗传图谱中保守区域( b l o c k ) 和 插入片段( i s l a n d ) 的位置。如果T N 遗传图谱的某个连锁群上有三个或三个以上连 续的标记能对应到拟南芥的2 1 个区段中的某一个区段，则认为T N 遗传图谱上这一 区段为与拟南芥对应的共线性区段。这些区段在拟南芥上的起始位置和大小与 甘蓝型油菜开花期及其相关性状O T L 定位 P a r k i n 等( 2 0 0 5 ) 报道的相同。共线性区段在 I N 遗传图上的大小，即共线性区段 起始和终止位置，由如下公式所确定： E 一乞一 一只三加 其中，P 6 为两个相连的共线性区段( 分别表示为A ，B ) 连接处的
14、遗传位置( 相应 的也为某这两个相连区段的终止或起始位置) ，和如分别为两个相连共线性区 段中最靠近共线性连接处位置的可比对标记的遗传位置，三州和妒分别为A B 区段 所对应的拟南芥片段相应的边界到相应标记的物理距离；如B 位于遗传图谱的开始 位置，则R 为0 ，如位于遗传图谱的结束位置，则B 等于遗传图谱的长度。对于只 有1 个或2 个连续的能对应到拟南芥共线性区段上的T N 遗传图上的标记，则视为插 入片段。对于位于这一遗传区段，却对应到拟南芥其它片段的标记，其所对应的区段 作为这一共线性区段的插入区段，插入区段在遗传图谱上的起始位置分别为这一标记 到与其左右相连的并可比对的标记的1 2
15、遗传位置处，在拟南芥对应片段的大小为其 所对应的遗传距离的大小与0 6 M b 的乘积，并且这一标记的物理位置位于这一片段的 中间。本部分工作是和本实验室黎瑞源同学共同完成的。 2 2 1 1 2Q T L 区间或互作位点对应开花候选基因的确定 将拟南芥中四个开花调控途径中的开花基因名称及其在基因组中的位置进行 整理。T N 遗传图谱上对应与拟南芥对应的保守区段中包含的开花基因数目是根据这 些开花基因在拟南芥中实际的物理位置决定的。基因间的距离根据它们在拟南芥中 实际物理距离的比例进行折算。如果这些基因位于Q T L 的置信区间或互作位点的标 记区间，则认为这些基因是Q T L 或互作位点对应
16、的相关基因。 23 结果与分析 2 31 亲本与两群体的开花期表型分析 自于用以构建T ND H 群体的亲本T a p i d o r 为冬油菜品种，而N i n g y o u 7 为半冬 性油菜品种，它们开花对低温的需求不同因此在不同的种植环境中二者在开花期 上均表现出明是的差异。在冬油菜种植环境中，两个材料均在越冬后的次年3 月，F 花，但在所有环境中T a p i d o r 开花时间均比N i n g y o u 7 晚。在春油菜种植环境中， N i n g y o u 7 能F 常丌花，而T a p i d o r 却不能正常现蕾和开花( 图2 - 1 ) 。 图2 - 1 两个亲本在不同种植环境的田间表现 刚A 为两采本在冬油菜环境中的表型；囝B 为两采本在春油菜环境中的丧掣。 F i g 2 - 1P h e n o t y p e o f t h e t w o p a r e n t
