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1、 1 L019 甘油介导的疏水色谱复性重组人L019 甘油介导的疏水色谱复性重组人-干扰素干扰素 李京京 1 王芳薇2,3 刘永东1 罗天乐1 闭静秀1 苏志国1 （1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080；2. 大连理工大学, 辽宁 大连 116024；3. 大连医科大学第二临床医学院， 辽宁 大连 116027） 摘摘 要要 本文建立了一种有效的干扰素复性的方法，将疏水色谱和具有水化能力的渗透质甘 油相结合用于重组人-干扰素的复性，旨在保持疏水介质抑制蛋白聚集的能力，同时使蛋白质在 逐渐增加的亲水环境中折叠，并加强蛋白质自身的疏水坍塌趋势，最后导致天然结构的
2、恢复。疏 水介质溶液分批辅助-干扰素复性结果表明，聚集沉淀被成功地抑制，然而可溶性干扰素收率随 介质的疏水性增强而下降，说明疏水介质可以抑制聚集，但介质疏水性过强会阻止干扰素折叠， 导致其吸附， 弱疏水介质则提高可溶性干扰素的收率。 Poros ET 复性干扰素的蛋白收率为 68.2， 而直接稀释的收率为 45。 变性-干扰素在高浓度盐的缓冲液中吸附到 Poros ET 疏水柱 (1.24.5cm I.D., 5ml) 后，盐酸胍梯度将其释放，含不同浓度甘油的复性缓冲液用作洗脱剂。结 果显示，20甘油介导下复性的-干扰素蛋白收率为 84，比活为 3.0108IU/mg, 无甘油介导时 只有 4
3、3的蛋白收率, 且复性产物比活较低， 说明甘油的介入能显著促进蛋白质折叠而提高活性 收率。荧光光谱用于鉴定复性-干扰素的结构，发现 20甘油介导下 Poros ET 复性的干扰素 最大吸收波长与天然结构一致。 反相色谱分析显示， 20甘油介导下 Poros ET 复性干扰素的活性 峰含量显著高于稀释复性的可溶性产物,而疏水性更强的 Poros PE 和 50%的甘油浓度不利于活性 结构形成。 关键词关键词: 复性 -干扰素 疏水色谱 甘油 渗透质 REFOLDING INTERFERON ALPHA WITH HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY ASS
4、ISTED BY GLYCEROL LI Jingjing 1, WANG Fangwei 2, LUO Tianle 1, BI Jingxiu 1 and SU Zhiguo 1 (1, National Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, P.O.Box 353,Beijing 100080, P. R . China, 2,Dalian University Of Technology, DaLian , LiaoNin
5、g , P. R . China, 116024,3, Second Clinical college, Dalian Media University, DaLian, LiaoNing, P.R.China, 116027) Abstract A promising approach for the refolding of recombinant interferon alpha was investigated. The strategy involving the combination of commercial available hydrophobic media and gl
6、ycerol, a typical osmolyte with hydration capability, is introduced to refold protein and prevent protein aggregation. Glycerol is involved to provide an increasing hydrophilic environment favorable for folding process and facilitate hydrophobic collapse of proteins to form 2 native structure. For h
7、ydrophobic media-assisted refolding of interferon alpha in batch, it is found that aggregation is successfully prevented and soluble protein recovery decreases with improving hydrophobicity of media. Nevertheless refolding process will be restrained by the media with too strong hydrophobicity, compa
8、ratively, weak hydrophobic media results in higher soluble protein recovery. 68.2% of the soluble protein recovery was obtained by Poros ET comparing to 45% of recovery by dilution refolding. Unfolded interferon alpha was further adsorbed by Poros ET column (1.24.5cm I.D., 5ml) at high salt concentr
9、ation. A guanidine hydrochloride gradient is used to release bound protein followed by elution with refolding buffer containing glycerol in various concentrations. The result shows that soluble protein recovery reaches 84% and the special activity of refolded interferon alpha is as high as 3.0108IU/
10、mg in the presence of 20% of glycerol. Comparatively, only 43% soluble protein recovery with low special activity is obtained in the absence of glycerol. Fluorescence spectrum was utilized to confirm the structures of refolded products at different conditions and indicated that the structure of refo
11、lded IFN by Poros ET and 20% of glycerol was near native state. RP-HPLC analysis shows the content of active peak of refolded IFN by Poros ET and 20% of glycerol is evidently higher than that by dilution. However, Poros PE with too strong hydrophobicity and excessive glycerol is unfavorable to form
12、the correct structure of refolded protein. Keywords refolding, interferon alpha, hydrophobic interaction chromatography (HIC), glycerol, osmolyte 3 引 言 当外源性重组蛋白质在原核细胞中过量表达时， 往往形成不溶的无活性的包涵体。 包涵 体具有抗酶解和易于纯化等优点1，但是它需要采用 67M 盐酸胍或 8-10M 脲溶解然后再 复性才能得到有活性的蛋白质。尽管 Anfisen 蛋白质一级结构决定高级结构的理论2指出随 着变性剂的除去变性蛋白质能自发
13、地恢复天然结构， 然而分子内折叠和分子间聚集是一个相 互竞争的过程。 传统的复性方法由于聚集沉淀而活性蛋白收率很低， 且随着复性蛋白浓度的 提高聚集更加显著。 一些助溶剂可以部分提高复性收率然而它们不能广泛用于高浓度下的蛋 白质复性3,4 。 近年来由于柱上复性具有一些溶液复性无法比拟的优点而逐渐受到重视， 色谱基质内的 网状结构是分隔蛋白质从而减少折叠过程中聚集的天然屏障。 凝胶过滤能通过限制不同形式 的折叠复性产物的扩散速率而减少聚集的机会5-7。变性蛋白质还能通过非特异性或特异性 的相互作用在变性状态下结合到色谱柱上， 然后降低变性剂浓度使其逐渐折叠， 最后用提高 洗脱液的离子强度或添加
14、特异的洗脱剂等方法洗脱得到复性蛋白质，如离子交换色谱复性 8-10.和金属螯和色谱复性11-12。本实验室采用发展了脲梯度以及脲pH 值双梯度的色谱复 性方法，使复性收率显著提高10。此外采用末端非极性基团和聚乙二醇手臂的特殊配基的 疏水色谱也被尝试用于复性某些蛋白质13。 然而目前尚未见商业化疏水介质复性蛋白质的文献报道。 疏水色谱是居于蛋白质表面疏 水性差异的分离手段14，当它用于蛋白质复性时，介质的配基可以和具有较多暴露基团的 变性蛋白质及折叠中间体发生疏水相互作用， 从而抑制分子间的聚集。 然而这种介质与蛋白 质分子间的疏水作用可能会和作为蛋白质折叠驱动力的分子内疏水作用相互竞争， 商
15、业化疏 水介质为了获得高载量而采用了密度较大的配基，无疑加剧了介质与蛋白质之间的疏水作 用，从而可能抑制折叠过程，形成错误结构甚至发生不可逆吸附。因此疏水介质与蛋白质间 的相互作用应当弱于蛋白质自身的疏水坍塌作用力，如果要将商业化疏水介质复性蛋白质， 就需要在复性过程中加强蛋白质表面的水化， 逐渐减弱介质和蛋白质间的疏水相互作用， 从 而促进蛋白质的正确折叠。渗透质能通过加强蛋白质的水化而促使蛋白质稳定15，可以设 想， 在疏水介质复性蛋白质的过程中引入渗透质可以通过其水化能力而促进蛋白质疏水坍塌 的折叠过程， 而且它还可以在蛋白质分子表面建立水化层， 从而防止蛋白质分子间的相互靠 近，并且可
16、以消弱疏水介质与蛋白质分子间的疏水作用，减少不可逆吸附。 在此，我们采用-干扰素作为模型蛋白质，引入一种将商业化疏水介质与渗透质相结合 复性蛋白质的新方法。变性的干扰素在高盐条件下吸附到 Poros ET 疏水柱中，然后采用 变性剂与含甘油的复性缓冲液梯度洗脱，成功地复性了干扰素。考察了不同疏水介质和 甘油浓度对干扰素复性过程的影响， 采用了荧光光谱和反相高效液相色谱(RPHPLC)对不 同条件下的复性干扰素进行了鉴定。 4 1 材料和方法 1.1 材料材料 Poros ET, Poros PE, Poros HP 购自美国 Applied Biosystem 公司。 Phenyl Sepharose Fast Flow, Octyl Sepharose Fast Flow, Butyl Sepharose Fast Flow, AKTA purifier 10 色谱系统购自瑞 典 GE healthcare 公司。 Waters 600E 高效液相色谱系统购自美国
