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1、急性心肌梗死的临床生化指标及检测方法,郑欣宁，郑思涵，杨芳芳，李金泽,医学检验3班,概述,一、概述,心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。 急性心肌梗死(Acute myocardial infarction， AMI)是主要的心血管疾病，全球每年有1700万人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死。 急性心肌梗死既往在欧美常见，美国3584岁人群中年发病率男性为71%，女性为22%，每年约有150万人发生急性心肌梗死，45万人发生再次心肌梗死。 在我国，本病虽不如欧美多见，但近10年来，急性心肌梗死的发病率呈明显上升趋势，目前已接近国际平均水平。
2、,AMI是指急性心肌缺血性坏死，大多是在冠脉病变的基础上发生冠脉血供急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久地急性缺血所致。通常原因为在冠脉不稳定斑块破裂、糜烂基础上继发血栓形成导致冠状动脉血管持续、完全闭塞。 AMI发病突然，急性期死亡率约为30%。对其早期诊断，以便进行及时有效的治疗，是减低急性心肌梗死的死亡率和合并症、提高患者生存率的关键。,诊断AMI的条件有：临床症状、心电图异常和生化指标等。 但大约1/3的AMI病人早期临床症状不典型，约1/2的病人心电图不能出现特征性ST段改变，此时生化指标的改变在AMI诊断和指导治疗中就显得非常重要. 目前，研究人员已基本弄清楚急性心肌梗死患者血清
3、中一些生化指标发生的变化及其规律。,二、诊断AMI的常用生化指标,肌酸激酶及其同工酶 乳酸脱氢酶及其同工酶 肌红蛋白和碳酸酐酶 心肌型脂肪酸结合蛋白 糖原磷酸化酶BB 超敏C-反应蛋白 其他,、肌酸激酶及其同工酶,肌酸激酶（CK） AMI患者血液中CK常在发病后46小时开始升高，1824小时达峰值，3天左右降至正常。 进一步的研究发现，CK的灵敏度仅为22%，且由于CK并非心肌所特有，在非心脏手术或骨骼肌、平滑肌损害患者血清中CK也会升高，所以其特异性仍较差。,肌酸激酶同工酶（ CK-MB ） CK-MB在AMI发病46小时开始升高，1224小时达高峰，可为正常的20倍，约2天降至正常，对AM
4、I诊断具有较高的敏感性，其阳性率在90%以上。在相当长时期内，CK-MB被誉为诊断AMI的“金标准”。 但CK-MB并非心脏所特有的酶，正常人骨骼肌中也有少量CK-MB，且CK-MB诊断时间窗口短，其敏感性和特异性都不尽如人意。尽管如此。,、乳酸脱氢酶及其同工酶,乳酸脱氢酶（ LDH ） LDH在AMI发病后24小时开始升高，34天达高峰，持续12周消失。 影响LDH的因素较多，充血性心力衰竭、肿瘤、骨骼肌疾患等均可使LDH升高。所以，通常不用LDH作为AMI早期诊断指标，而适用于诊断病程已超过23天的病例。,乳酸脱氢酶同工酶（ LDH1 ） AMI后LDH1在68小时增高，35天达峰值，持续
5、714天。以LDH1/LDH21和CK-MB15 IU/L作为AMI的诊断标准，其阳性率前者(52.2%)明显高于后者(30.4%)。随发病时间延长，LDH1/LDH2比值逐渐升高，至24小时达高峰，持续2周，该比值的阳性率还在95%以上。 因此，该比值测定对心肌梗死的早期及晚期的诊断均有一定价值。,、肌红蛋白和碳酸酐酶,肌红蛋白（ Mb ） Mb最早可在梗死后1.5小时开始升高，512小时达到高峰，24小时恢复正常。 Mb的诊断特异性低，因肌肉损伤、肾功能减退以及长期肌注、开胸手术等因素均可使之升高。Mb对心肌特异性不高，但Mb是心肌缺血损伤后升高最早的指标之一。与CK共同为适合于AMI的早
6、期诊断指标，且Mb阴性有助于排除AMI。另外，由于血中Mb能迅速被肾脏清除，所以测定Mb还有助于观察AMI病程中有无再梗死发生，以及梗死有无扩展。,肌红蛋白/碳酸酐酶比值（Mb/CA III ） 胸痛发生2小时内，Mb和Mb/CA III显示出相当高的灵敏性，分别为40%和60%，在26小时内，这两项指标的敏感性比CK-MB更高。 在骨骼肌损伤时，Mb和Mb/CA III均升高，但Mb/CA III保持恒定，而心肌损伤时，Mb/CA III明显升高。同时测定血清Mb和CA III，用Mb/CA III比值有利于区别Mb是来源于心肌还是骨骼肌。测定Mb/CA III在AMI诊断中具有较高的灵敏性
7、和特异性，是诊断心肌损伤的早期标志物之一。,、心肌型脂肪酸结合蛋白,心肌型脂肪酸结合蛋白（ H-FABP ） 血清H-FABP在AMI早期(03小时)即可检测到。 H-FABP自上世纪90年代起开始作为诊断AMI的早期诊断指标，它对诊断AMI的敏感性、特异性和准确率均较高。但 目前临床应用还不广泛，它与肌红蛋白一样，缺少对心脏的特异性。,、糖原磷酸化酶,糖原磷酸化酶BB（ GPBB ） GPBB主要存在于心肌细胞和脑细胞中，在正常生理条件下，GPBB在心肌细胞中以GPBB-糖原复合物的形式与肌浆网紧密结合。当心肌缺血缺氧时，糖原分解加速消耗，使与之结合的GPBB由结合型变为游离型，心肌细胞中释
8、出来。 GPBB被认为是最为敏感的诊断AMI的指标之一，其特异性与CK-MB相似。,、超敏C-反应蛋白,C-反应蛋白（CRP） C-反应蛋白是一种急性时相反应蛋白，对疾病的诊断虽无特异性。但其血浆水平上升是各种原因引起的炎症和组织损伤的灵敏指标，且在很长一段时间可保持稳定。 HS-CRP可作为心血管危险事件发生进行的预测指标。HS-CRP水平3-5mg/L可作为心肌梗死危险性分级的较佳临界点。在冠心病患者中HS-CRP升高提示冠状动脉病变可能与炎症反应有关。,、其他,其他的用于判断心肌损伤的生化标志物还有如门冬氨酸氨基移换酶(CAST)、肌球蛋白重链(MHC)和轻链(MLC) 、肝细胞生长因子
9、、B型钠尿肽(BNP)、脱氧核糖核酸酶以及-羟丁酸脱氢酶等。但由于其特异性或敏感性原因，使得这些心肌损伤标志物的临床应用受到了一定的限制。,从总的趋势来看，随着医学科学研究的进展，心肌损伤的血液生化标志物已从早先的以酶活性为主的检测（如 AST，LD及其同工酶、CK及其同工酶等）发展到目前的以蛋白质质量浓度为主的检测，包括多种早期标志物和晚期标志物，随着这些新的灵敏、特异的心肌损伤标志物的广泛应用，以酶活性为主的检测项目在诊断心脏疾病时已逐渐少用以至不再应用。 另外，多种标志物的联合使用可以使各种标志物互为补充，弥补单一标志物的某些不足。,心肌肌钙蛋白,一、概述,心肌蛋白(Troponin ，
10、 Tn)是肌肉组织收缩的调节蛋白，与原肌球蛋白(Tropomyosin)和肌动蛋白(Actin)结合构成肌原纤维的细肌丝，参与肌肉的收缩和舒张过程。 心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin， cTn)是心肌细胞内结构蛋白，由三种亚基组成，包括Ca2+结合亚基-肌钙蛋白C (TnC)，抑制亚基-肌钙蛋白I (cTnI)和与原肌球蛋白结合亚基-肌钙蛋白T (cTnT)，三种亚基组成复合体，调节肌肉收缩活动。,在心肌细胞受损后，随肌原纤维崩解破坏而不断释放进入血液。其中cTnC不能作为心脏特异性标志物，因为骨骼肌cTnC与心肌cTnC的氨基酸序列是完全相同的。而cTnT与cTnI在心肌与骨骼
11、肌中具有独特的氨基酸排列，所以心肌中cTnT和cTnI具有心肌特异性，其远比CK，CK-MB等酶变化更为敏感，能检出酶学方法检查不出的微小的心肌坏死。肌钙蛋白是目前为止发现的辅助诊断心肌损伤的最佳确定标志物，,2002年检验学会在其公布的“心肌损伤标志物的应用准则”中建议: 将心肌肌钙蛋白(cTnT或cTnI)取代CK-MB成为检出心肌损伤的金标准。,二、心肌肌钙蛋白T,心肌肌钙蛋白T（ cTnT ）是20世纪90年代发展起来的一种新的诊断心肌缺血、坏死的高敏感性、高特异性的血清学指标。cTnT参与构成心肌调节蛋白，其结合于心肌细胞收缩器上，分子量为37000 D 。 AMI后23小时cTnT
12、就升高，24天达到峰值，cTnT活性可较正常上限升高数十至百倍以上，1214天下降至正常。在AMI后，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，诊断AMI的绝对敏感窗口在cTnT也较CK、CK-MB宽，其中cTnT为10.5140小时，而CK和CK-MB是931小时。鉴于cTnT浓度升高持续时间长，其对长期间诊断，对回顾性诊断都是非常适宜的指标。,最近研究发现，cTnT在骨骼肌损伤、肺部疾病、肾衰竭时也升高，其心肌特异性较心肌肌钙蛋白I（cTnI）低。,三、心肌肌钙蛋白I,cTnI是心肌细胞所特有的一种收缩蛋白，仅存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上，是一种单链多肤，分子量为22500 D。 肌钙蛋
13、白I(cTnI)含有三个亚型:快反应型、慢反应型、心脏特异型。前两者与骨骼肌相关，后者仅存在于心肌中。cTnI与骨骼肌Tn的氨基酸序列显示40%不同源性，且cTnI肤链的N端增加了31个氨基酸，分子量为24 。cTnI在胎儿及健康或疾病状态的成人骨骼肌中不表达，因此具有高度心肌特异性，为cTnI作为心肌细胞损伤的特异性标志物奠定了基础。,在人心肌组织内cTnI的含量约为5mg/g湿重组织。生理状态下，cTnI以两种形式存在于心肌细胞内，少量cTnI (3%5%)游离于细胞浆中以游离形式存在，为可溶性，大部分以结构蛋白形式固定于心肌肌纤维上，为不可溶性。 正常人血液中cTnI含量一般低于0.3g
14、/L，当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流，随着损伤加重，结合部分的cTnI被分解出来，成为游离的cTnI不断释放入血，导致cTnI持续升高。,四、比较cTnI和cTnT的诊断价值,比较cTnI和cTnT作为早期诊断心肌损伤的价值： cTnT在出现骨骼肌损伤、肾衰竭等疾病时也升高，而 cTnI分子量较小，正常血中浓度很低，心肌损伤后能快速释放入血液中，且呈百倍升高，且在血清中持续性存在; 因此，cTnI是目前效率最高的诊断AMI标志物。,2001年11月美国心脏病学会和心脏病协会提出测定cTnI作为诊断AMI和急性冠状动脉综合症危险分层的第一位标
15、准。 在人类心肌损伤的诊断中，cTnI已经成为“金标准”之一。,心肌肌钙蛋白I的测定方法,一、化学发光免疫分析法,实验原理： 化学发光免疫分析法(CLlA)是化学发光法和免疫分析法结合的产物。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性。 CLlA是用化学发光反应的试剂（可以是发光剂或催化剂等）标记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤（如离心分离，洗涤等），然后再加入氧化剂或酶底物，最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。,基本类型： 化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类:直接标记化学发光物质的化学发光免疫分析、以酶为标记物的化学发光酶免疫分
16、析和以电化学发光物质为标记物的电化学发光免疫分析。,实验材料： 待测血清； ALP-Avidin，Biotin，Sulfo-NHS-Biotin，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液； AMPPD； 化学发光检测用微量反应板； 多标计数仪等；,生物素-检测抗体(Biotin-IgG2)复合物的制备： 清洗平衡浓缩离心管：以PBST清洗浓缩离心管，在其顶部填充PBST，以5000rpm 4离心4 h。 浓缩抗体、更换支持缓冲液：加入0.5mg待标记抗体，以5000 rpm离心40 min以浓缩抗体，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液1.5mL，以5000rpm离心，重复1次，加入HEPES缓冲液0.4mL，振荡混匀。 标记生物素：加入0.2 mL Sulfo-NHS-Biotin，震荡混匀，室温反应30min。加入含0.5%叠氮钠的HEPES缓冲液2 mL，以5000 rpm离心5 h，重复4次，最后将沉淀物以HEPES缓冲液重新悬浮至0.5ml，储存于4
