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1、烟台大学 硕士学位论文 琥珀酸产生菌的分离鉴定、诱变选育及其应用研究 姓名：刘晓艳 申请学位级别：硕士 专业：生物化工 指导教师：徐世艾 20090601 I 摘 要 琥珀酸是三羧酸循环的中间产物，同时也是微生物代谢的产物之一，在医药、 食品、化工等行业有着广泛的用途。近年来，由于微生物发酵法生产琥珀酸成本低 廉、对环境污染少，已成为国内外的研究热点。 考虑到中国传统发酵食品例如白酒、黄酒在其发酵过程中都有一定量的琥珀酸 生物合成这一事实，本文从酿酒大曲中成功分离筛选出一株具有淀粉水解能力的琥 珀酸产生菌，在液体马铃薯培养基中发酵 96h，采用高效液相色谱法测得其发酵液中 琥珀酸含量可达 63
2、 mg/L。根据丝状真菌常用的鉴定方法，通过对菌株培养特征和形 态特征的观察，对该菌株进行了初步鉴定。结果表明该菌株为真菌门（Fungi） 、藻 菌纲（Phycomycetes） 、毛霉目（Mucorales） 、毛霉科（Mucoraceae） 、毛霉属（Muco） 、 总状枝毛霉组（Racemousus）中的总状枝毛霉（M.racemosus Fresenius） 。将其命名 为 M.racemosus Fresenius MF-1。 然后对筛选出的菌种 MF-1 采用各种理化因子进行诱变选育， 以期筛选到琥珀酸 优良菌株。本文采用氯化锂、紫外线、He-Ne 激光和 60Co- 射线四种诱变
3、因子分别 对霉菌 MF-1 的孢子和原生质体进行诱变处理， 实验结果表明该菌株的原生质体对以 上几种诱变因子较为敏感，诱变效果较好。通过对菌株 MF-1 的原生质体进行紫外与 He-Ne 激光的复合诱变及 60Co- 射线诱变后，经过反复筛选，最终获得一株琥珀酸 突变株 MSCo-24， 三角瓶水平上液体发酵测得其琥珀酸产量为 2.08 g/L， 是出发菌株 MF-1 产酸量的 31.04 倍，而且该菌株的遗传性状稳定，可作为进一步诱变选育的出 发菌株。 最后对突变株 MSCo-24 在啤酒糟蛋白饲料固体发酵中的应用进行了初步研究。 对固体发酵培养基的配比及发酵条件进行了初步优化，确定了固体培
4、养基的最佳配 比为啤酒糟 70%，麸皮 17%，玉米面 10%，(NH4)2SO4 3%，最佳发酵条件为接种量 7.5%，料水比 1：3。结果表明：原料中粗蛋白含量由 15.00%提高到了 30.33%，并 有 2.53%的琥珀酸产生，从而大幅度提高了啤酒糟作为饲料的附加值。 关键词：琥珀酸 分离 鉴定 诱变选育 蛋白饲料 II Abstract Succinic acid, a intermediate in citric acid cycle, is produced by microbial metabolism. It has widely potential and practica
5、l use in several fields, such as medicine, food, chemistry et al. Because of low processing cost and little pollution for environment, the research for succinic acid fermentation has become the hotspot at home and abroad in last years. As we all know, there are some succinic acid product in the cour
6、se of fermentation of Chinese traditional fermented food, such as distillate spirit and yellow wine. A strain producing succinic acid was successfully isolated from brewing wine Daqu, which had the ability of starch hydrolysis. And the yield of succinic acid of the strain reached 2.08 g/L after 96 h
7、oursliquid fermentation in PDA medium, which was measured by high performance liquid chromatography (HPLC). Then according to the common identification method of the mold fungus，the strain was initially identificated by cultural and morphological characterization as M. racemosus Fresenius which belo
8、nged to Racemousus， Muco， Mucoraceae， Mucorales， Phycomycetes in Fungi. And it was named M.racemosus Fresenius MF-1. To abtain succinic acid mutant strains, the spores and protoplasts of the strain MF-1 were induced by different physical and chemical factors, such as LiCl, UV, He-Ne laser, 60Co- ray
9、. The results showed that the protoplasts of the strain MF-1 were more sencitive to these mutant fators than the spores, and the mutative effect was better. After the protoplasts from spores of the strain MF-1 were irradiated by UV, He-Ne laser and 60Co- ray, a mutant strain MSCo-24 was finnally obt
10、ained by re-screening, whose yield of succinic acid is 2.08 g/L by liquid fermentation in flask level, about 31.04 times of its parent. After being propagated for five generations, the strain MSCo-24 showed a more stable heredity, which could be as starting strain for further study. Production of pr
11、otein feedstuff was primarily studied with the mutant strain MSCo-24 on brewers spent grains by solid state fermentation. The ingredients of medium III and fermentation condition affecting mold (MSCo-24) for protein production had been primarily optimized. Through orthogonal test, the best formula f
12、or the substratum had been obtained: beer grains 70%, wheat bran 17%, corn meal 10%, (NH4)2SO4 3%. And the optimum condition for fermentation was as follows: the inoculation was 7.5%, and the ratio of material and water was 1:3. The content of the crude protein in fermentation medium can be increase
13、d to 30.33% from15.00%, and 2.53% succinic acid was produced, thus substantially enhance the added value of brewers spent grains feed. Key words: succinic acid; isolation; identification; mutation breeding; protein feedstuff 烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明烟台大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师
14、的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明学位论文使用授权说明 本人完全了解烟台大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校 要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版， 并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保 存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 （保密
15、论文在解密后遵守此规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 57 版权声明 任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人，未经本论文作者同 意，不得将本论文转借他人，亦不得随意复制、抄录、拍照或以任何方 式传播。否则，引起有碍作者著作权之问题，将可能承担法律责任。 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 烟 台 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 1 前言 琥珀酸（succinic acid）学名丁二酸，最初是 1546 年德国科学家阿格里科亚在蒸 馏琥珀时得到，因而得名。琥珀酸广泛存在于人体、动物、植物
16、和微生物中，是三 羧酸循环的中间产物，同时也是微生物代谢的发酵产物之一，很多微生物生产琥珀 酸盐作为它们能量代谢的主要终产物。琥珀酸是一种很重要的有机化合物，广泛用 于医药、食品、塑料和化工等各个领域。近年来，由于不断开拓新的应用领域，国 际市场上需求猛增，呈现出诱人的发展前景。目前，琥珀酸主要使用石化方法生产， 这种方法成本高，有污染。因此，微生物发酵法生产琥珀酸越来越受到人们的广泛 关注。 1.1 琥珀酸的理化性质及应用 1.1.1 琥珀酸的理化性质 琥珀酸是一种常见的天然有机酸，其分子式为 C4H604，相对分子量 118.09，其 结构如图 1.1 所示。纯净的琥珀酸为无色至白色的三斜晶体或单斜晶体，有 、 两 种晶型。比重d4251.572，熔点 180187 ，沸点 235 。溶解于水，微溶于醇、 醚、酮类，不溶于苯、四氯化碳1。 图 1.1 琥珀酸的结构式 Fig.l.1 Structural formula of succinic acid 琥珀酸是一种二元羧酸，在 25 时，琥珀
