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1、第五章 分子生态学方法在环境 微生物研究领域的应用,农学系生物技术专业课程微生物学研究进展,一、微生物分子生态学的理论 二、微生物分子生态学的研究方法 三、展望,墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。,1、传统培养法的瓶颈,微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于 什么原因？ 各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远不能反映出自然界微生物
2、多样性的丰度和范围。,一、微生物分子生态学的理论,2、微生物分子生态学的产生,为了突破传统纯培养方法的限制，必须要有一种能绕过纯培养这一步的新技术，来推动微生物多样性的研究。,微生物分子生态学的产生使得微生物群落的研究由细胞水平深入到分子机制研究水平,提出了微生物分子进化和分子适应等全新概念,使微生物生态学理论更加接近自然本质。,3、微生物分子生态学的概念,利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与生物及非生物环境之间相互关系及其相互作用规律的科学。 主要研究微生物区系组成、结构、功能、适应性发展及其分子机制等微生物生态学基础理论问题。,墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉
3、没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。,二、微生物分子生态学的研究方法,1、研究路线,2、荧光原位杂交（ FISH ）,利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检测系统，对DNA或RNA进行定性或定位分析。,2、基于16S rDNA的指纹图谱法,为什么选择16S rRNA基因作为微生物进化的遗传标记?,方法：,16S rDNA克隆文库 / ARDRA DGGE/TGGE RFLP/T-RFLP RISA（ITS） SSCP, 构建16S rDNA克隆
4、文库,ARDRA,优点 得到的序列信息比较完整 片段携带的信息量大，结果可靠 适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析 缺点 工作量大 不能对目标种群进行原位和实时监测,Vinh D. Pham等人用16S rDNA文库结合fosmid方法研究了阿拉斯加某中温油藏采出水中细菌和古细菌的多样性，结果表明古细菌和细菌数量均等，未培养微生物约占检出总量的30%左右，检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。 佘跃惠等人也用16S rDNA文库结合TGGE方法研究了大港孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，结果表明注水井中的微生物多样性比采油井中丰富，注水井样品中的细菌主要属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细
5、菌亚纲(47%)。采油井样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属(62%)。 通常采用构建16SrDNA文库方法与其它分子生物学方法联合，对环境微生物群落结构进行分析。,16S rDNA克隆文库数据分析,根据不同的酶切图谱分型后，可以得到该环境样品中的微生物组成信息。同时，根据每一个OTU所含的克隆数目，也可以推测出该环境中的优势菌群。,以大庆油田采出水样品古菌文库为例：, 变性梯度凝胶电泳DGGE,产生： 1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于检测DNA片段中的点突变的一种电泳技术 原理： 碱基组成不同DNA序列，其解链温度也各不相同。由此，便可通过设定不同的变性条件（变性
6、剂浓度或者温度）将不同的DNA片段分开。 特点：分离大小相同，但碱基组成不同的序列,16S rDNA的高可变区,E. coli 16S rRNA二级结构及各可变区,V3区 约170bp V6-V8区 约350bp 片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域得到DGGE图谱不同，群落信息也有差异 不同的片段大小对应的胶浓度也不同 根据需要选择最合适的,提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区片段,确定合适的变性剂范围,对DNA片段进行有效分离,根据变性剂梯度方向与电泳方向相同或不同,DGGE分为： 垂直DGGE 平行DGGE,GC-Clamp 调节目的序列的解链行为，为一段40bp的高GC含
7、量的片段 常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率。 应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100 %。,当等长的双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,因其解链的速度和程度与其序列密切相关; 部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小。,DGGE的参数：,胶浓度 取决于片段大小 ，通常不宜超过500bp 6%胶浓度： 400 1000bp 8%胶浓度： 200 400bp 10%胶浓度：100 300bp 变性剂范围 不同的样品不同 温度 一般都用60摄氏度 电压 时间,环境样品分析的流程,DGGE在微
8、生物分子生态学中的应用,对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。 通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的 多样性。 跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养 条件对分离菌种的影响。,举例：,油藏古细菌 V3区 DGGE 图谱 胶浓度：10% 变性剂范围：40%-60% 电压：200V 运行时间：4.5h,优点： 缺点： 分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。 一般只能分析500bp以下的片段。 PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。,RFLP（限制性片段长度多态性）,探针： 限制性内切酶： Hind、BamH、 EcoR、EcoRV、Xba等。,优点
9、 遍布整个基因组，数据多态信息量大 结果非常稳定，重复性好，探针多 缺点 技术复杂，周期长，费用高 检测中需放射性物质，限制了广泛应用 DNA量大，分析速度慢,T-RFLP（末端限制性片段长度多态性）,每个荧光峰至少代表一个细菌或几个近缘的细菌 每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，可粗略认为与细菌在某一部位的微生态群落中的相对数量,T-RFLP的优点： 相对于其它方法，T-RFLP技术分析更为迅速，且结果可以数据的形式输出，因而在微生物群落的快速检测和分析中更有优势。,三、展望,使用微生物分子生态学方法，绕过了纯培养的瓶颈，可以普遍的、定量的、系统的描述微生物的多样性
10、，从而能够以相对无偏见的方式了解环境中的微生物及其生态系统。,存在的问题：,环境样品在提取核酸前,无论是厌氧或是室温存放，样品 中的微生物仍不可避免的发生一些变化。 每次提取DNA的效率不同,影响结果的重复性; 提取核酸时, 细胞的裂解程度不均一; 引物对样品中不同微生物核酸扩增效率不同; 在真核微生物生态学的分析上还是比较少。,现在，微生物分子生态学研究已经超越了单纯说明环境微生物群落结构的阶段； 重心转移到了群落功能方面的研究，一方面要求深入挖掘已有方法的潜力，另一方面也尝试着多种方法的联合，最终分析清楚各种微生物在生态系统中发挥的作用，将微生物群落结构和群落功能联系起来。 这也是微生物分子生态学研究的最终目的。,
