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1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 环孢素A 降尿蛋白的非免疫性机制的研究 AS t u d yo f t h eN o n i m m u n em e c h a n i s mo f c y c l o s p o r i nA i n r e d u c i n gp r o t e i n u r i a 课题来源：白筹经费 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 肾脏病学 杨芸 史伟教授 刘岩教授 纪玉莲 刘俊 尹良红 龙海波 秦曙光 余细勇 论文评阅人傅钟舟 迹侣 木f 一 刘双信 2 010 年5 月19日 广州 硕士学位论文 1 1 1 1 I
2、 II 1 l I 1 I I l Y 17 7 0 3 2 6 环孢素A 降尿蛋白的非免疫性机制的研究 硕士研究生：杨芸 指导老师：史伟 摘要 研究背景 蛋白尿既足肾脏损伤的标志和临床治疗指标，也是肾小球疾病向小管损伤、 问质纤维化进展并最终发展为尿毒症期的重要危险因素。肾小球血液滤过屏障 自内到外依次包括：内皮细胞构成的孔窗结构；高度水化胶原成分的肾小 球基底膜( g l o m e r u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e ，G B M ) ；足细胞足突及山其构成 的裂孔隔膜( s l i td i a p h r a g m ，S D ) 。作为肾
3、小球血液滤过功能的最后屏障，足细 胞( p o d o c y t e ) 的改变几乎参与了所有的蛋白尿相关性肾病的发生，并在蛋白 尿相关性肾脏疾病发展进程中起着关键作用。目前对足细胞分子结构的研究主 要集中在裂孔隔膜复合体( S D s ) 区，包括：n e p h r i n 、p o d o c i n 、C D 2 A P 、 Z O 1 ；顶端膜蛋白区：P o d o c a l y x i n 、G L E P P 1 ；基底膜相接触的基底蛋白区： a 3 1 3 1 整合素、D y s t r o g l y c a m 足细胞骨架蛋白：s y n a p t o p o d i
4、 n 、a c t i n i n 一4 、F - a c t i n 等。这些对足细胞分子结构的认识从某种程度上为蛋白尿发生的分子机制提供 了依据。但是对于蛋白尿发生的足细胞损伤及对其治疗有效的分子水平的研究， 目前仍无突破性的进展。 最新研究发现：足细胞p 3 整合素活化、活动增强可导致足突融合和蛋白尿。 尿激酶受体( u r o k i n a s er e c e p t e r , u P A R ) 是B 3 整合素共受体，其细胞膜内段很短， 大部分结构位于细胞表面与整合素及细胞外基质结合。正常情况下，分化成熟 的足细胞处于相对静止状态，不具有分裂增贿的能力，其表达多种足细胞特有
5、的分子标志物，通过p l 整合素料i 附于基底膜；而经u P A R 途径的B 3 整合素活 摘要 化可直接导致足细胞活动力增强及蛋白尿发生。P e t e rM u n d e l 等教授认为( K i d I m ，2 0 0 9 ) 蛋白尿发生涉及到足细胞上一系列酶的分解合成等信号变化，后者 最终影响到足细胞的活动及骨架的改变。 环孢素A ( C y c l o s p o r i nA ，C s A ) 被广泛应用于器官移植和免疫性疾病中， 是具有里程碑意义的免疫抑制剂。目前，环孢素A 已逐渐应用于各种肾小球疾 病，并取得了很好的疗效，尤其是环孢素A 能够有效地降低各种难治性肾病综合
6、症中的尿蛋白，然而，其作用机制的研究仍缺少突破性进展。传统观点认为， 环孢素A 主要通过抑制免疫( 作用于T 细胞) 发挥抗蛋白尿效应，而目前最新 研究发现：环孢素A 降蛋白尿的作用靶点之一是足细胞，这解释了“为什么在 非免疫性。肾脏疾病中环孢素A 仍然能有效降低尿蛋白? ”。但是对于环孢素A 在减少蛋白尿发生及足细胞损伤过程中，究竟扮演着怎样一个角色仍不清楚。 本研究通过建立脂多糖( L i p o p o l y s a c c h a r i d e ，L P S ) 诱导小鼠蛋白尿模型和经典的 5 6 肾切除大鼠模型两个非免疫性蛋白尿模型以及体外脂多糖足细胞损伤模型， 观察环孢素A 对
7、于非免疫因素损伤引起的蛋白尿的影响及环孢素A 对于足细胞 p 3 整合素表达、活化及足细胞迁移力的影响，探讨了环孢素A 对于足细胞活动 力改变的影响及其降低蛋白尿、稳定足细胞进而缓解难治性肾脏疾病中的非免 疫性作用，以期阐明环孢素A 降蛋白尿的作用机制。 研究方法 一、建立非免疫性蛋白尿模型( 脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型和5 6 肾切除大鼠 模型) ，观察环孢素A 对蛋白尿的影响 ( 一) 脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型制作：1 5 只C 5 7 B L 6 雄性小鼠随机分为- F 常对照组( C o n ) 、L P S 处理组( L P S ) 、L P S 与C s A 共同处理组( L P S
8、 + C s A ) ， 每组5 只，C s A 溶入二甲基亚砜( D M S O ) 2 0 避光保存，L P S 溶入生理盐水 4 “ C 保存。L P S 组腹腔注射L P S2 0 0 u g ，并于第二天给予D M S O + 生理盐水灌胃 L P S + C s A 组腹腔注射L P S2 0 0 u g ，并于第二天给予C s A2 5 m g k g J + D M S O + 生理 盐水灌胃，C o n 组给予等量生理盐水腹腔注射及D M S O + 生理盐水灌胃。第三 硕士学位论文 天处死动物。 ( 二) 5 6 肾切除大鼠模型的制作：2 4 只S D 雄性大鼠随机分为假手
9、术对照组 ( S h a m ) 、5 6 肾切除组( N T X ) 、5 6 肾切除+ 低剂量C s A 干预组( N T X + C s A l ) 、 5 6 肾切除+ 高剂量C s A 干预组( N T X + C s A 2 ) 。N T X + C s A l 组行5 6 肾切除手 术，一周后每R 给予C s Al m g k g 。1 灌胃，N T X + C s A 2 组行5 6 肾切除手术，一 周后每R 给予C s A 5 m g k g 。1 灌胃，N T X 组行5 6 肾切除手术，一周后每同给予 等量D M S O 灌胃，S h a m 组行假手术，一周后每F 1
10、给予等量D M S O 灌胃。 ( - - ) 时间点设置及2 4 小时尿蛋白检测和肾组织观察：脂多糖诱导小鼠蛋白 尿模型于第2 天留取2 4 h 尿液检测蛋白浓度及尿肌酐浓度后处死并留取肾组织， 5 6 肾切除大鼠模型分别于2 周、4 周、8 周、1 2 周留取2 4 小时尿液检测尿蛋 白量后处死并取肾组织。 ( 四) 脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型中肾组织切片激光共聚焦观察 s y n a p t o p o d i n 、活化p 3 整合素表达。 二、足细胞培养、鉴定及实验分组 ( 一) 足细胞培养：条件永生性小鼠足细胞由B a y l o r 医学院D a n e s h 教授惠赠。 首先在
11、5 C 0 2 ，3 3 。C 培养箱环境，用含2 0 I O O U m L I F N 一丫的R P M I1 6 4 0 和1 0 F B S 放入I 型胶原包被的培养瓶中共孵育，使其获得增殖能力。然后转入5 C 0 2 ，3 7 。C 培养箱，用不含I F N 叫的D M E M 加1 0 F B S 共孵育，经1 0 一1 4 天的 培养诱导，足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。 ( 二) 足细胞鉴定及形态学观察：分别对3 3 0 C 含I F N Y 培养及3 7 0 C 不含I F N 吖培养 l O 1 4 天分化成熟后的足细胞在相差显微镜下直接拍片，观察其形念学差异；表 达足细
12、胞骨架蛋s y n a p t o p o d i n 的细胞为分化成熟的足细胞，未分化的足细胞不 表达s y n a p t o p o d i n 蛋白。一 ( 三) 按以下分组干预处理足细胞： 正常对照组( C o n ) ：不加任何干预凶素分化成熟的足细胞； L P s 组( L P S ) ：5 0 m g L J 脂多糖0 成熟足细胞共刚孵育2 4 h ； 摘要 C s A 处理组( L P S + C s A ) ：用5 0 m g L 以脂多糖及0 5 m g L 1 环孢素A 共同干预 2 4 h ： 三、总B 3 整合素及其活化以及u P A R 的表达 分别用免疫荧光、流
13、式细胞术及定量P C R 检测p 3 整合素合成、活化及u P A R 表达的变化。 四、足细胞活动力检测 ( 一) 转板迁移测定法( T r a n s w e l lm i g r a t i o na s s a y ) ：使用龙胆紫染色后，在倒 置显微镜下摄片，观察正常对照组、L P S 处理组及L P S 与C s A 共同干预组足细 胞迁移的变化。 ( 二) 刮除法( W o u n dh e a l i n ga s s a y ) ：在I 型胶原包被的六孔板爬片上培养细 胞后，刮除细胞后给予不同的处理，观察下常对照组、L P S 处理组及L P S 与C s A 共同干预组足细
14、胞损伤修复的变化情况。 五、统计学处理计量资料数据以均数4 - 标准差( x s ) 表示，应用S P S S l 3 0 统 计软件进行统计学分析，结果用单因素方差分析( O n e w a yA N O V A ) 方法，方 差齐性用L S D 法进行组问多重比较，方差不齐用D u n n e t t ST 3 法进行组问多重比 较。P 0 0 5 - 1 ；但是p 3 整合素的共受体u P A R ( P l a u r ) m R N A 表达，L P S 组明显高于C o n 组、L P S + C s A 组，具有统计学意义 ( 1 3 4 士0 2 9 ) v s ( 1 0 2
15、 士0 1 7 ) 、( 0 8 7 士0 1 7 ) ，P 值分别为0 0 2 2 、0 0 0 2 3 。 ( 二) 活化p 3 整合素的表达：免疫荧光下可见C o n 组足细胞膜上不表达活化 的活化p 3 整合素，免疫荧光强度较弱；而在L P S 组可见在足细胞膜周有活化p 3 整合素表达增加，荧光亮度较强；而L P S + C s A 组其活化B 3 整合素下调，荧光 亮度较弱。用流式细胞术检测平均每个细胞所带的荧光量发现L P S 组高于C o n 组及L P S + C s A 组，具有显著的统计学意义 ( 6 7 5 4 士1 9 8 1 ) V S ( 2 2 8 9 土8 8
16、 O ) 、 ( 3 3 9 4 士8 0 。0 ) ，P 值分别为0 0 0 0 、0 0 0 2 ，而L P S + C s A 组与C o n 组无显著统 计学差异( 卢0 2 1 5 ) 。 四、环孢素A 对足细胞活动力影响 ( 一) 转板迁移测定法( T r a n s w e l lm i g r a t i o na s s a y ) 在C o n 组、L P S 组及L P S + C s A 组，平均缚个视野细胞数分别为( 1 8 8 士3 2 ) 个、( 3 0 9 1 2 2 ) 个和( 2 3 6 士1 4 ) 个，L P S 组高于其他2 组，具有显著的统计学意 义( 均P = 0 0 0 0 ) ( 二) 刮除法( W o u n dh e a l i n ga s s a y ) 为了更豆接的分析足细胞的活动力改变情况，我们用刮除法术检测足细胞的 V I 硕
