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1、第一章 概述一、植物组织培养定义和原理定义：是指将植物体的细胞、组织或器官的一部分，在无菌的条件下接种到特定的培养基上，在一定的容器内培养，从而得到新个体的方法，也叫离体培养。培养的离体材料称为外植体。根据所取得外植体的来源和培养对象的不同可分为：胚培养，器官培养，愈伤组织培养，细胞培养（以分散的细胞或小的细胞团外植体），花药和花粉培养，原生质体培养（去除细胞壁，以裸露的原生质体为外植体）等。愈伤组织：原是指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。再生植株：在花卉组织培养过程中，所采用的外植体经过诱导能够重新进行器官分
2、化，长出芽、根、花等器官，最后形成的完整植株。原理：植物细胞的全能性。细胞的全能性：指一个植物细胞具有产生一个完整植株的固有能力。也就是说，植物细胞具有全套遗传信息，不管是性细胞还是体细胞，在特定环境下均能表达，而产生一个独立的、完整的植株。二、植物组织培养的发展简史（一）萌芽阶段（20世纪初至20世纪30年代中）在Schleiden和Schwann创立细胞学说基础上1902年德国植物生理学家Haberlandt提出，人们可以培养植物的体细胞成为人工胚。对植物组织培养发展起了先导作用。1922年Kotte和美国的Robbins，采用无机盐、葡萄糖和各种氨基酸培养豌豆和玉米的茎尖，形成了缺绿的叶
3、和根，能进行有限的生长。1925年Laibach将亚麻种间杂交不能成活的胚取出培养，使杂种胚成熟，继而萌发。2.奠基阶段（20世纪30-50年代初期）1934年美国植物生理学家White培养番茄的根建立了活跃生长的无性繁殖系，并能进行继代培养。 1937年首先配制成综合培养基，发现了B族维生素对离体根生长的重要性。同年法国的Cautheret、Nobecouer培养块根和树木形成层使其生长。White、 Cautheret和Nobecouer确立的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物组织培养的技术基础。1943年，White提出了植物细胞“全能性”学说，并出版了“植物组织培养手册”，使其成
4、为一门新兴学科。1955年,Miller等发现了细胞分裂素/生长素的比值，成为控制器官发育的模式，促进了植物组织培养的发展。3.蓬勃发展阶段（50年末至今）1958年，英国学者Steward在美国将胡萝卜髓细胞培养成为一个完整的植株。这是人类第一次实现了人工体细胞胚，证明了植物细胞的全能性。使植物组织培养的第一个突破。1960年英国学者Cocking用酶法分离原生质体成功，开创了植物原生质体和体细胞杂交的工作。 1960年，植物组织培养技术已开始应用于花卉领域。使热带兰的快速繁殖成为现实。这标志着花卉组织培养开始步入实际应用阶段。 1964年，印度学者Guha 和Maheshwaris成功地从
5、曼陀罗花药培养成花粉单倍体植株，从而促进了植物花药单倍体育种技术的发展。 70年代以后，植物组织培养迅速发展 l 此后，植物组织培养和细胞培养技术不断发展和完善，并与重组DNA相结合产生的植物遗传转化研究成为植物基因工程的重要内容。4.我国组织培养技术的发展我国组织培养研究工作开展较早，1931年李继侗培养银杏的胚，19351942年罗宗洛进行了玉米根尖离体培养。20世纪70年代以来我国开展了植物花药培养单倍体育种。80年代，我国在花芽培养和原生质体培养方面达到了一个高峰，90年代，组织培养被广泛应用于果树和花卉等的生产。三、组织培养的特点培养材料经济；培养条件可认为控制；生长周期短，繁殖率高
6、；管理方便，利于自动化控制四、植物组织培养的应用快速大量繁殖优良品种用于育种获得无病毒苗次生代谢产物的生产种质资源的保存和基因库的建立1. 快速大量繁殖优良品种1960年，Morel用兰花茎尖离体培养成功。目前用于快速繁殖的花卉与数百种，如月季、菊花、牡丹、花叶芋等。以花叶芋为例，常规繁殖每年仅几倍到十几倍，组织培养则每年可繁殖出几万至数百万倍的校幼苗。这对珍稀、优、新品种更为重要。组培苗的繁殖速度是以几何数量级增长的。2. 用于育种从天竺葵鼠细胞培养物中选出了有香味的“天鹅绒玫瑰”品种，用秋水仙素处理百合组培苗，获得多倍体百合，表现花大早花等特点，花叶芋在培养中未经处理，获得染色体数为60的
7、4倍体植株，其生长粗壮，叶大而厚，花也大，增加观赏价值，玉簪嵌合体培养中得到了金色斑点兼具绿色斑点的植株；从绿色菊花瓣培养中，选出了开紫花的植株。1）胚培养在植物种间杂交或远缘杂交中 ，有时虽然能正常受精，但由于胚败育或杂交中受精受阻，这时可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用花粉受精，称“试管受精”。 2）单倍体育种利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植株，从而缩短育种年限和世代。 3）用于体细胞杂交体细胞杂交和植物基因工程是以植物组织培养为基础的，借助于组织培养利用体细胞杂交克服远缘杂交的不亲和性。4）突变体育种在组织培养过程中，可以把试管
8、苗逐步放于越来越低的培养温度下，诱变和筛选抗寒植株。或把试管苗逐步放于NaCl含量越来越高的培养基上诱变和筛选耐盐突变体植株。如中国林科院获得了耐盐体细胞突变体杨树植株，现已进入大田试验。试管苗也可在卫星和飞船上搭载，并经筛选后，发现新的突变体。5）用于基因工程20世纪80年代以来，人们从植物目的基因的分离，基因工程载体的组建，细胞的基因转化，转化细胞的组织培养和植株再生，直到外源基因表达的检测手段等方面，都取得了很大进展。3. 获得无病毒苗长期用有性繁殖或无性繁殖，会使病毒积累，危害加重，花卉品质下降，花变小，产花少。若去病毒后，植株长势强，花朵变大，色泽鲜艳，抗逆能力提高，产花数量上升。通
9、常用茎尖培养去病毒。原理是：在生长点病毒含量最低，在分生区内无微管束，病毒扩散慢，加之植物细胞不断分离增生，所以病毒含量少，在茎尖生长点几乎检测不出病毒。因此切取茎尖愈小愈好。4. 次生代谢产物的生产过去，人们一直从各种植物中提取可用于工业、医药生产的次生代谢产物。由于野生资源植物的不断减少及人类社会需要的不断增加，再加上这类植物往往生长缓慢、生长环境特殊即不断遭到破坏等原因，导致这些植物天然产物远不能满足人们的需要。随着植物组织和细胞培养技术的不断发展和完善，人们已实现了植物次生代谢产物的工厂化生产。5. 种质资源的保存和基因库的建立目前，全世界面临着环境污染和热带森林资源的破坏，平均每天有
10、2种植物从地球上消失，这是全人类物种财富的损失。植物组织培养提供了若干方法，供种质资源得以保存，对于挽救珍稀濒危的植物极有意义。利用组织培养技术低温保存种质，可节省大量的人力、物力和场地。如将葡萄试管苗保存在温度9度以下，植株便停止生长，每年只需接转一次。几百个葡萄品种，即使每个品种重复6个，只需1m2场所就可保存下来。同时还便于种质交换和转移，避免有害病虫的人为传播。而常规基因库不仅要占用大量的土地，并且每年的维护管理费用高，还耗费较多的人力和物力。五、植物组织培养的发展前景1. 组培容器的大型化2. 组培技术的简单化3. 组培环境的自然化第二章 植物组织培养实验室一、实验室的分区组培的实验
11、室，通常包括无菌操作室，配制培养基准备室，培养材料用的培养室，检查培养情况并作记录的细胞学实验室。此外，工业化生产还需有用于栽培组培苗（试管苗）的专用温室或遮荫棚等。1.药品室：放置植物组织培养所需的各种花学试剂。花学试剂应首先按液体和固体分类；然后按作用分类，如消毒剂放在仪器，培养基的成分放在一起，进而按大量元素、微量元素、有机物、琼脂、蔗糖的类别摆放。2.洗涤室：用于各种玻璃器皿、用具及培养材料的清洗。洗涤室地面要耐水湿。3.准备室：用于培养基的配制、分装、包扎，以及干燥后的玻璃器皿、灭菌后的培养基、用具的存放。4.灭菌室：用于培养基、器皿、工具的灭菌消毒。灭菌室的墙壁和地面最好能防潮、耐
12、高温，并做通风处理。5.缓冲室：防止带菌空气直接进入接种室。一般用紫外灯消毒，墙上设衣帽钩，门旁放一鞋架。6.接种室：进行植物材料的无菌操作，是组织培养研究或生产工作中的最关键的部分，关系到污染率、成活率、接种工作效率等。接种室墙壁、天花板要求光滑，地面要求平坦无缝，避免灰尘积累，易于彻底清洗和消毒。门窗要求密闭，最好用滑动门窗，以减少空气的流动。7. 培养室：培养植物材料的场所。一般要求温度在252度之间，每天光照1214h。不同的植物材料对光、温、湿的要求不同，应区别对待。8. 观察室：用于进行细胞学或解剖学观察和植物材料的摄影记录。9. 驯化移栽室（温室）：用于组培苗的练苗和移栽。二、植
13、物组织培养室的设计设计原则一般按照工艺流程顺序排列，（培养器皿的清洗，培养基的配制、分瓶、封口和灭菌，材料的表面灭菌和接种，进入培养室的培养，试管苗的出瓶、移栽及其管理。三、实验器材设施在培养过程中，从外植体的选取到试管苗的定植都必须在特定的器材中进行，如培养基的配制、植物的接种等要用专用的器材,常用的器材有：基本仪器设备：分析天平：称少量化学药剂药物天平：称取培养基等的药品酸度计：测pH值长工作距大视场连续变倍体视显微镜1台电热鼓风干燥箱人工气候箱：用来烘干器械超净工作台：用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操作。高压灭菌锅：对培养基、接种器材进行灭菌处理照度计温湿度计冰箱：储存药剂
14、、植物材料等空调：供升温或降温培养架：放培养瓶用。一般6层较合适，总高2m，最上一层高170cm，每30cm为一层，最下一层距地面20cm，架高以60cm为宜，每层架子上安23盏40瓦的日光灯，两灯之间距离为30cm。储物柜若干：用于各种药品、试剂、玻璃器皿等存放。紫外灯：对接种室、培养室等工作环境进行灭种处理10安定时器若干：用来自动控制培养室中照明地开关。平板小推车若干：注意再准备室、接种室、培养室门的设计时，不能留门槛。器械架：在无菌操作室用来放置灭菌的器械塑料盆：清洗培养容器纯水水桶：有效去离子水或蒸馏水细菌过滤器：用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液玻璃器皿：量筒：量取一定体积的液体烧
15、杯：盛放、溶解化学药品玻璃棒：配制培养基磨砂玻璃瓶：放培养基母液，以及其他药品容量瓶：配制标准溶液 移液管：移取定量液体试管、培养皿、锥形瓶：作外植体的培养容器工具耗材：剪刀：修剪外植体或剪切嫩茎等吸耳球：用于移液管吸取各种液体药匙：转移药品无菌滤纸：用来吸取器材、植物材料表面的水分无菌脱脂棉：进行器械植物材料表面的灭菌处理纱布：用于在流水清洗接种材料时，可防止植物材料随水流走，用纱布蒙住容器口，用小水流冲洗。托盘封口膜试管刷四、玻璃器皿的清洗清洗玻璃器皿用得洗涤剂有肥皂、洗涤剂、洗衣粉、高锰酸钾溶液，有时也用铬酸洗涤液。若是新购置的玻璃器皿，由于它们会或多或少还有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲一遍，干后备用。对已用过的玻璃器皿，先将器皿中的残杂除去，用清水洗净，再用热的肥皂水或洗洁净洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。对已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿则必须在121度高压灭菌锅灭菌30分钟后，趁热倒去残杂，用清水冲洗，然后用肥皂水清洗，清水、蒸馏水冲。总之，洗净的玻璃器皿应透明发亮，内外比外膜均匀，不挂水珠。一、无机营养元素
