五种基因克隆技术

《五种基因克隆技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《五种基因克隆技术（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、国 内 信 息 五种基因克隆技术 经华中农业大学周国岭先生对国内外64篇有关基因克隆技术的论文概括和分析,当前基因克隆技术主 要有5个类别,即体位克隆或状态克隆、 转位或转DNA标记法、 同系位候选基因法、 快捷顺序标记法、 差接 式快捷基因克隆法等。 1 体位克隆或状态克隆 首先将目的基因精确定位于分子标记连锁图上,用连锁标记筛选大片段YAC ,BAC ,TAC ,PAC或Cos2 mid等文库,构建含目的基因区的精细物理图谱,采用染色体操作法逐步接近目的基因,如拟南芥的WIG2 GUM基因克隆,人的NPC1基因克隆。若侧翼标记与目的基因连锁非常紧密,就可获得包含目的基因的大 片段克隆。将此

2、作亚克隆分析或作探针筛选DNA文库,并将目的基因定位于一个较小的DNA片段上,再 作序列分析与功能鉴定;若从DNA文库中取BAC或PAC克隆末端序列分离体位克隆,利用BACP或PAC 载体特有酶切位点Not I或sfi I和BAC片段中多酶切位点EcoRV ,HpaI ,StuI ,XmnI进行双酶切再与质粒 体连接,并用PCR来分离,则对BAC长链末端序列的分析和鉴定就更快速而高效。 体位克隆或状态克隆曾用于分离与拟南芥种子形成和发芽相关的脱落酸信号传导基因ABI3、 拟南芥 - 3脂肪酸脱饱和酶基因FAD3、 番茄抗霜霉病基因Pto、 水稻抗白叶枯病基因XaZ1、 小麦抗线虫基因Cre3

3、以及200多个与人遗传性疾病相关基因的克隆。 这一类别的克隆虽然作用很大,但由于需要构建基因组文库,建立饱和分子标记连锁图,要完善遗传转 化体系,还要作大量测序工作,故此法投资较大,应用也有一定的局限性。但随着比较基因组学的发展,可利 用同科异种间染色体共线性,通过比较基因组分析和染色体的稳定性,可将物种性状基因或分子标记直接定 位于该分子标记连锁图中。如将小麦控制开花基因(Vrn)和水稻控制谷粒硬度基因(Ha)定位于第5组染色 体上;又如利用水稻图谱信息筛选水稻和小麦同线区的BAC或YAC测序和搜索候选基因。也还有较多的 将QTL定位于分子标记连锁图上,借鉴体位或状态克隆法分离贡献率大的QT

4、L来改良某些不良性状而适 合现代农业的要求。 2 转位或转DNA标记法 此法有五大基本程序,即首先进行突变体的诱变和鉴定;第二用转位或转DNA作标记DNA制成探针 或引物筛选突变体基因组文库;第三用反义PCR技术分离出标记DNA两侧的目的基因部分序列;第四依据 序列设计探针或引物筛选野生型基因组文库,并分离出完整的基因;第五用基因互补测验手段检测此法的功 能。 利用此法可克隆到玉米抗圆斑病基因HML ,利用其AC/ DS系统克隆到番茄抗叶霉病基因Cf - 9 ,利用 其En/ Spm系统克隆到拟南芥的1个雄性不育基因,利用其Mutator系统克隆到玉米T -胞质中1个核恢复 基因rf2 ,还可

5、利用此法克隆到1个调节花器官发育的转录因子基因AG和拟南芥中1个抗线虫有关的基 因。 由于此法多用于异源植物,转位频率不高,拷贝数过多,易使诱变频率很低,难以获得转位突变体,而亲 本所含转位或通过转基因或杂交进行转位才能引入,故此法有其局限性。特别对特定环境或特定发育阶段 有突变表型基因或和大基因组中以基因家族形式存在与有功能补偿的部分基因家族。在转位过程中虽然发 生插入突变,但不易看到突变表型。 这也使转位或转DNA标记法仅限于分离克隆那些有明显插入突变表 生物技术通报 国内信息 BIOTECHNOLOGY BULL ETIN 2002年第6期 型的基因。为此,此法发展成转位收集或俘获的无表

6、型突变基因,包括增强子俘获和基因俘获两种。当前由 于DNA测序技术飞快发展,大量基因序列信息和未知功能的基因被发现,利用转位DNA标记法鉴定基因 生物功能的技术更加广泛。 3 同系位候选基因法 为同源序列候选基因法,根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计引物,以此对含有目的基因DNA 文库用PCR扩增,再扩增、 克隆和功能鉴定。对植物抗病基因所具有保守氨基酸序列(核苷酸结合位点 NBS、 富亮氨酸重复序列LRR、 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶STK、 亮氨酸拉链LZ和横跨膜结构TM等 ) , 设计引 物扩增植物DNA文库,并从所获得的抗性克隆中找到一些新的抗性候选基因。诸如根据谷氨酸脱氢酶基 因GDH

7、结构中某些序列存在物种中的保守性设计引物,经RT - PCR扩增产物制备探针筛选龙须草cDNA 文库,可获得GDH的整个cDNA ;根据高度同源性基因,可直接制备探针作杂交筛选出另一物种DNA文库, 再用豌豆淀粉合成酶SS 的cDNA作探针筛选小麦的cDNA文库,可获得小麦SSa的cDNA ;根据红海鲷 和红鳟鱼的生长激素GH基因的cDNA筛选gsb的cDNA文库,获得gsbGH的cDNA克隆;还根据gsbGH 的cDNA筛选gsb的基因组文库,克隆出gsb GH基因。 对此法,国内外生物技术学者虽然广泛重视,但也提出了应注意的问题: 由于密码子的简并性和不同 源序列之间的同源程度差异,对简并

8、性引物特异性设计一定要周密、 完善和适当; 由于某些同源序列并不 专层某一基因家族,因而扩增产物就不一定是某一基因家族的成员; 由于基因家族成员多成族存在,在运 用此法所克隆出的基因片段是否是目的基因,尚需深入判断和鉴定。为此,PCR扩增产物和克隆出来的基 因,需作基因及其性状分离分析和遗传转化功能的鉴定,以便筛选到目的基因,以区别同源区域的基因还是 趋异区域的基因。如原癌基因、 同源异型基因、 肌球蛋白基因等。 4 快捷顺序标记法(EST) 在人类基因组和其他生物组计划及计算机的运用过程中,EST是完整基因上能特异性标记基因的一部 分序列,它包含了基因结构信息区,可与其他基因相区别。大规模E

9、ST克隆及其资料库的建立,为进一步利 用生物信息学克隆基因提供了有利条件。其步骤有六: 对已知部分序列作数据库分析,筛选出代表新基因 的EST及相应重叠群与定位信息,并设计引物和制备探针; 利用探针筛选cDNA文库,获得cDNA阳性克 隆,用引物和cDNA载体臂进行巢式PCR和5 、3 2RACE ,获得5 端和3 端部分400bp序列; 测序阳性克 隆和末端序列; 分析数据库中新序列包括基因同源性、 拼接延伸、ORF识别、 结构和翻译蛋白质等; 若发 现有新EST定位信息,即可对基因作定位和结构分析,否则要重筛选基因文库,作测序和FISH定位; 对 发现出的新基因应作突变检测和表达分析。 目

10、前,应用EST法快捷、 经济、 效果都很好。国际相当数量的基因分离是从分析同源EST开始的,如发 现和克隆肿瘤基因、 克隆新一簇哺乳动物DNA52胞苷甲基转移酶基因。分析克隆到细胞分裂素的1个横跨 膜受体基因GCR ,分析发现3个前列腺特异表达基因,可用于前列腺癌的基因治疗。 5 差接式快捷基因克隆法 亦为差异表达基因分离法,其表达基因的3种方法为差式筛选、 扣除杂交、 差异展示反转录PCR(DDRT - PCR)。差式筛选分别从有特异表达基因的目标样(TS) 和无特异表达基因的参照样(RS)中提取mRNA、 反转录为cDNA构建TS的cDNA文库,又分别将TS和RS中的mRNA制成cDNA探

11、针,用TS和RS的 cDNA探针与Ts cDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交,选出只与TS杂交的TS特异表达的克隆;扣除杂 交是用TS提取mRNA反转录成cDNA探针与RS过量的mRNA或cDNA杂交,移去杂交分子和过量的RS 的mRNA或cDNA ,将不形成杂交体的TS的cDNA纯化、 富集、 扩增,建立差异表达基因cDNA文库,回收 cDNA;DDRT - PCR是分别用TS和RS的总mRNA作模板,用12个锚定引物T11MN错定mRNA的 polyA末端,借助逆转录酶合成cDNA第一链,获得mRNA/ cDNA ,再用相同的3 错定锚定引物和5 端随机 742002年第6期 生物技术通报

12、Biotechnology Bulletin 引物分别扩增TS、RS的mRNA/ cDNA ,其扩增产物用序列胶电泳分析差异表达结果,并将差异带DNA回 收、 分析、 鉴定,以获得最终差异表达基因。秦春圃 应用FISH评估IFN治疗CML的疗效 应用间期荧光原位杂交技术(FISH)评估干扰素(IFN)治疗慢性粒细胞白血病(CML)有较好疗效。主 持这一技术(FISH)的山东济宁市第一人民医院的李强医生等,为探讨FISH检测CML IFN治疗体内残留 Ph阳性细胞的效果,采取间期FISH的方法,对7例未治疗CML病者和17例IFN - 2b长期治疗CML 病者进行治疗,并检测体内Ph阳性细胞的变

13、化。其结果:正常对照组假阳性率为3. 87 %(0. 94 %) ,确定 正常值小于6. 68 %( - 3s) 。未治疗组Ph阳性细胞平均为89. 21 % ,IFN治疗组Ph阳性细胞平均为44. 86 % ,与未治疗组相比没有显著性差异(P 0. 05)。细胞遗传学有效病患者Ph阳性细胞平均为26. 30 % ,与 未治疗组相比有显著性差异P 0. 05) ,且Ph阳性细胞的减少与IFN的用药总剂量具有相关性(r = - 0. 666 ,P = 0. 002)。 应用间期FISH技术的结果,有许多优越性和良好效果。首先,所用bcr探针全长近300kb ,横跨m - bcr 的M - bcr

14、 ,使典型CML能够显示bcr一个完整信号和两个重排的信号;其次,本技术检测的假阳性率为 3. 87 % ,表明新建立的方法能有效判断Ph阳性细胞,而未治疗组存在Ph阴性细胞,主要与杂交信号重叠、 靶细胞未完全灭活和探针杂交不完全及T细胞未受克隆累积有关。其阴性率出现10. 79 % ,表明检测结果 精确可靠;第三,FISH的结果与细胞遗传学结果明显相关并具有四大特征: 在细胞遗传学检测Ph染色体 尚无变化的情况下,FISH检测却有明显变化; 在 中,前者显示Ph染色体转阴时,后者仍然发现其Ph细 胞克隆趋势在减少。这表明后者不受细胞分裂周期影响而更精确判断IFN治疗后体内的荷瘤量; 细胞遗

15、传学检测可能反映不同病患者体内恶性克隆细胞增殖状况差异,但是否代表CML自身异质性,IFN治疗的 敏感性、 预后的相关性,这与FISH完全缓解不同患者之间的结果不相一致,故尚待深入作对比研究;IFN 治疗有效的病患者,其用量与其Ph阳性细胞的残留量呈显著负相关。为此,可借鉴这种显著负相关,应用 于早期判断IFN的敏感程度和用药的时限。 总之,间期FISH ,比染色体核型、RT - PCR技术更能准确评价IFN治疗CML对体内的负荷量和治疗 CML的真实疗效。它是一种敏感、 定量、 精确判断CML用干扰素治疗的实用技术,而且还可作为一个有用 的指标判断病患者对干扰素的敏感性。为此,应用间期荧光原

16、位杂交技术评估干扰素治疗慢性粒细胞白血 病患者的疗效是好的,特别是比起国内外传统方法有较大的优越性和临床实用价值。 秦春圃 猪胚发育分子调控机理与基因转殖猪 近年来,台湾大学畜产系和有关研究机构,对畜禽生物分子学与胚胎分子学调控方面的研究有一定进 展,在猪滤泡发育分子调控、 猪胚胎发育分子调控和基因转殖猪的研究都取得了重大成果。 1 猪滤泡发育分子调控 台大畜产系在动物生殖细胞早期发育和在育种遗传方面起步较早,他们在90年代后期,用聚合酶链反 应技术(PCR)成功地研究了我国梅山猪、 桃园猪、 小耳猪和国外兰德瑞斯、 约克夏、 杜洛克猪等的激滤泡素接 受体基因FSHR5 端上游区城的基因片段,如梅山猪的这种片段长度为1112bp ,桃园猪的为1042bp ,小耳猪 的为1096bp ,兰德瑞斯的为1049bp ,约克夏的为1043bp ,杜洛克的为1055bp。这些为畜禽分子育种和基因 转殖的生物学研究创造了有利条件,奠定了基础。 84 生物技术通报Biotechnology