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1、天然产物有效成分的提纯分离与结构鉴定,第二章,教学目的与要求：,掌握天然产物化学成分提取分离的原理及方法,了解用波谱法测定天然产物化学成分结构的一般方法,1,主要内容,一、天然产物有效成分提取方法的原理 溶剂提取法与水蒸气蒸馏法的原理、操作及其特点,二、天然产物有效成分分离与精制 天然产物有效成分各种分离方法的原理,三、化合物的纯度测定,四、结构研究的主要程序,五、结构研究中采用的主要方法 UV IR MS NMR,2,第一节 天然有效成分的提取,溶剂法,水蒸气蒸馏法,升华法,3,一、溶剂提取法,1、溶剂提取法及其原理,根据“相似相溶”原理，选择与化合物极性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出
2、来，同时，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其极性与溶剂极性相差较大的化合物也可溶解出来。,溶剂提取法是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。,4,2、常用溶剂的特点,环己烷,石油醚,苯,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,丙酮,乙醇,甲醇,极性：小 大,亲脂性：大 小,亲水性：小 大,5,比水重的有机溶剂：氯仿,与水分层的有机溶剂：环己烷 正丁醇,能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇,与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮 甲醇,极性最大的有机溶剂：甲醇,极性最小的有机溶剂：环己烷,介电常数最小的有
3、机溶剂：石油醚,常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分 的有机溶剂：正丁醇,溶解范围最广的有机溶剂：乙醇,6,运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；溶剂不能与中药的成分起化学变化；溶剂要经济、易得、使用安全等。,3、溶剂的选择,7,4、各种溶剂提取法,连续回流提取法等,浸渍法,渗漉法,煎煮法,回流提取法,8,浸渍法：浸渍法系将天然产物粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。,渗漉法：渗漉法是将天然产物粉末装在渗漉器中，不断
4、添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。,9,01 溶剂罐 02 变频物料泵 03 快速渗漏机 04 流量计 05 渗滤液罐 06 可调试电加热水箱 07 热水泵 08 高效旋转薄膜蒸发器 09 浓缩液罐 10 冷凝器 11 冷却器 12 受却器 13 真空泵 14 控制柜,SLNS-快速渗漉提取浓缩机组工艺流程图,10,SLNS-快速渗漉提取浓缩机组,11,煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应
5、锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。,回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约12cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时后放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。,12,连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取天然产物有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取
6、器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。,13,14,二、 水蒸气蒸馏法,水蒸气蒸馏法，适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的天然产物成分的提取。此类成分的沸点多在100以上，与水不相混溶或仅微溶，且在约100时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时，液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出。,15,三 、升华法,固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。天然产物中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自天然产物中提取出来。,例如樟木中升华的樟脑（camphor），在本草纲目中已有
7、详细的记载，为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。,茶叶中的咖啡碱在178以上就能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类，有机酸类成分，有些也具有升华的性质。,16,四、影响提取效果的因素,溶剂提取的效果主要取决于选择合适的溶剂和提取方法。此外，原料的粉碎程度，提取温度，浓度差，提取时间，操作压力，原料与溶剂的相对运动等因素也不同程度地影响提取效果。,原料的粉碎程度：原料经粉碎后粒度变小，表面能 增加，浸出速度加快，但粉碎度过高，样品粉粒表 面积过大，吸附作用增强，反而影响扩散速度，并 不利于浸出，一般而言粒度以2060目为适。,17,浸出温度：温度增加可增大可溶性成分的溶解
8、度、扩散系数。扩散速度加快有利于浸提，并且温度适当升高，可使原料中的蛋白质凝固、酶破坏而增加浸提液的稳定性，但温度过高，会破坏不耐热的成分，并且导致浸提液的品质劣变。提取的杂质含量增高，给后道精制工序带来困难，一般浸出温度控制在60100。,浸提时间:原料中的成分随提取时间延长，提取的得率增加，但时间过长，杂质成分溶解也随之增加，给后序提取精制造成困难，一般而言，热提13h，乙醇加热回流提取12h。,浓度差:浓度差是原料组织内的浓度与外周溶液的浓度差异。浓度差越大，扩散推动力越大，越有利于提高浸出效率。,18,第二节 天然产物有效成分 的分离与精制,根据物质溶解度差别进行分离,根据物质在两相溶
9、剂中的分配系数不同进行分离,根据物质的吸附性差别进行分离,19,一、根据物质溶解度差别进行分离,1、结晶,结晶是利用温度不同引起溶解度的改变而使有效成分以晶体的形式析出以达到分离物质的目的。,（1）杂质的除去：天然产物经过提取分离所得到的成分，大多仍然含有杂质，或者是混合成分。有时即使有少量或微量杂质存在，也能阻碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时，必须注意杂质的干扰，应力求尽可能除去。,（2）溶剂的选择：制备结晶，要注意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂，最好是在冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大。溶剂的沸点亦不宜太高。,20,（3）结晶溶液的制备 ：制备结晶的溶液，需要
10、成 为过饱和的溶液。,（4）制备结晶操作,（5）重结晶及分步结晶：晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。,（6）结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，一可以作为鉴定的初步依据。,21,2、溶剂沉淀： 在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。,3、沉淀剂沉淀：（1）金属离子沉淀；（2）酸碱沉淀；（3）非离子型聚合物沉淀；（4）均相沉淀。,4、盐析沉淀,22,二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离
11、,1、液-液萃取与分配系数K值,K=CU/CL （2-1）,2、分离难易与分离因子,分离因子表示 A、B 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。 即： =KA/KB( 注：KA KB ) （2-2）,23,3、 分配比与pH,HA+H2O A-+H3O+,若使该酸性物质完全离解 ，则：,24,使该酸性物质完全游离，即使A-均转变成HA，则：,因为酚类化合物的pKa值一般为9.210.8，羧酸类化合物的pKa值约为5，故pH值为3以下，大部分酚酸性物质将以非离解形式（HA）存在，易分配于有机溶剂中；而pH12以上，则将以离解形式（A-）存在，易分配于水中。,同理，对于碱性物质（B）：,Ka为碱
12、性物质（B）的共轭酸（BH+）的离解常数。,25,一般 pH12,则酸性物质呈离解状态(A-)、碱性物质则呈非离解状态(B)存在。据此,可采用图1-1所示在不同pH的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法,使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。,26,27,两相溶剂萃取在操作中还要注意以下几点：,1）先用小试管猛烈振摇约1分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。,2） 水提
13、取液的浓度最好在比重1.11.2之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。,3） 溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取时，溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。,28,4）一般萃取34次即可。但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，须增加萃取次数，或改变萃取溶剂。,4、超临界流体萃取技术,超临界流体萃取是以某一介质作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离的组分的一种方法。,超临界流体由于接近液体的密度使之具有较高溶解度,由于接近气体的粘度, 使之具有良好的流动性能,扩散系数介于气液之间,使之对待萃取的物料组织有良好
14、的渗透性,这些特征大大提高了溶质进入超临界流体的传质速率。,29,(1) 超临界流体萃取的特点,萃取过程在较低温度范围内进行,特别适用于具有热敏性或易氧化的成分。萃取介质通常选用二氧化碳,二氧化碳化学性质稳定,无腐蚀性、无毒性、不易燃、不易爆,萃取后容易从分离成分中脱除,不会造成污染,适用于食品和医药行业。,工艺条件容易控制,通过对温度和压力进行调节, 可以实现选择性萃取和分离。,萃取产物的理化性质保持良好,产品质量好,且无溶剂残留问题,萃取介质循环利用,无环境污染问题。,超临界流体萃取需要冷媒和高压支持且生产量较小,操作成本大。,30,（2）超临界流体萃取的应用,由于超临界流体萃取技术上有许
15、多元可替代的优点,近年来获得高度的重视和广泛的应用,例如中药有效成分的提取；菌体生成物的分离；香精香料色素的提取；动植物脂肪、脂溶性成分、植物碱、甾醇类物质等成分的提取；有机溶剂以及有害有毒物质的脱除等。,31,5. 逆流分溶法(CCD),液-液萃取分离中经常遇到的情况是分离因子值较小, 故萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次。此时简单萃取已不能满足需要, 而要采用逆流分溶法( countercurrent distribution,简称CCD)。,32,CCD 法因为操作条件温和、试样容易回收,故特别适于中等极性、不稳定物质的分离。另外,溶质浓度越低,分离效果越好。但是,试样极性过大或过小
16、,或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。,33,34,6、液液分配色谱柱,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂 (流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。,（1）正相色谱与反相色谱：分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时,固定相多采用强极性溶剂,如水、缓冲溶液等,流动相则用氯仿、乙酸乙醋、丁醇等弱极性有机溶剂,称之为正相色谱；但当分离脂溶性化合物,如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时,则两相可以颠倒,固定相可用石蜡油,而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂,故称之为反相分配色谱 (reverse phase partition chromatography)。,35,（2）加
