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1、猪病检测手册目录猪瘟RT-PCR检测程序3猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序5高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序7猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序9猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序11猪细小病毒（PPV）PCR检测程序13猪圆环病毒型（PCV2）PCR检测程序15细菌学检测程序17 猪瘟RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料 冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1ml RNase-free管分装，每管500l，-20保存。取出冻存的猪瘟病毒，
2、解冻后离心，取上清用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.
3、5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（PH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。 RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。二、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-GACCTGGATGCGACTGACC-3 , 19bp ，TM为61.88。 R：5-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3, 20bp，TM为59
4、.85。扩增的目的片段为133bp。 2、 RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 3、 PCR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix
5、12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、56，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳 用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133bp的条带，判定为猪瘟病毒阳性。猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料 冻干PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗用2ml生理盐水或PBS液稀释，用
6、1ml RNAase-free管分装，每管200l，-20保存。取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产
7、的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（pH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。二、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（日本东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-CAACGCCAGCAACGACAG -3 , 18b
8、p，TM为59.58。 R：5-ACGGAACCATCAAGCACAAC-3, 20bp，TM为57.8。扩增的目的片段为468bp。2、RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 3、 P
9、CR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mix12.5lTotal25l反应程序： 1、94，3min2、95，30sec3、56，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳50min观察结果，在阳性对照出现468bp条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现468bp的条带，判定为PRRS病毒阳性。 高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料 阳性对照病料为该病的活
10、疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法
11、同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS继续研磨，匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心5min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50l RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。二、 RT-PCR反应1、材料 RT试剂盒（日本东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-TGATGGGCGACAATGTCC- 3 , 18bp，TM为55.56。 R：5- CGCAGGCAAATCCAGAGG-3, 18bp，TM为
12、61.11。扩增的目的片段为230bp。2、 RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free 水6l0特异性下游引物1l1l模板RNA5l11lTotal12l12l置于PCR仪上6510min，立即冰浴5min。然后加入以下试剂：变性后的RNA溶液12l5RT buffer4ldNTP mixture2lRNase Inhibitor1lRever TraACE1lTotal20l按以下程序反转录： 1、 42，45min 2、 99, 5min将cDNA -20保存。 1、 PCR反应体系及程序ddH2O7.5lcDNA3l上游引物1l下游引物1l2Master mi
13、x12.5lTotal25l反应程序：1、94，3min2、95，30sec3、52，30sec 35cycles4、72，1min5、72，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100ml加入5l染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现230bp条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现230bp的条带，判定为高致病性PRRS病毒阳性。 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序一 、病毒RNA的提取1、 阳性对照RNA的提取材料 阳性对照病料为该病的弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 RNA提取按试剂盒说明进行，最后用5
14、0l RNase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血液、腹股沟淋巴结、脑脊髓液、死产胎儿的脑组织、分泌物、脾、肿胀的睾丸等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，匀浆后-20反复冻融3次，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于R
