生物信息学与pcr

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1、第九章,聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction. PCR）,评价： * PCR是现今生物生命学科最关注、最爱用、 最欢迎的新技术。 * 被誉为：20世纪80年代出现的具有划时代 的、生命学科中革命性的新技术。 * PCR使生命学科发生变革，给生物医学的发 展注入无限活力。 * 公认PCR最具发展前景，最有生命力的一项 新技术。 * 最短时间获诺贝尔奖（86-93年）。 * 多么高的评价都不过分。,一、问题提出 背景: 分子生物学、遗传学的兴起， 反向生物学的诞生 （核酸、遗传物质，基因型表型）。 共同障碍： 如何在短时间内快速、获足够量、纯净的、 特异的目的DNA片

2、段/基因供使用，可检测。,1基础理论研究的需要 DNA重组、基因克隆、HGP测序，探针制备 2实际应用的需要 基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治 疗，基因预防等给人类带来希望。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶（I II III）,拓扑异构酶 解旋酶类 SSB,引物 dNTP Mg2+,Mullis的PCR构思,二、PCR的基本概念,概念 由一对引物介导，在体外对特定DNA片段进行 快速、酶促、扩增技术。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可

3、使目的DNA片段得到扩增。,PCR反应循环,前提：人工合成一对特定引物作向导， 始动DNA合成。 酶促：体外试管内进行酶促生化合成 （非化学合成）。 靶子：特导扩增目的靶序列（目的）。 高效：极微量模板、百万倍扩增 快速：短时高速完成实验。,内 涵：,三、PCR工作原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR过程：3步曲 + 1循环 高温变性 9097 降温退火 4555 适温延伸 72左右 反复循环,分四个阶段讲述其原理： （一）高温模板变性 制备好含有扩增靶序列/目的基因的样品DNA （模板DNA）。然后在高温下（90 - 95）使双 键模板DNA变性，解链，获得单链模板DNA，

4、为DNA 合成作好准备。 （二）降温引物退火 合成一对特导性引物，在25 - 55温度下， 引物与模板配对结合。,引物的作用有三：定位、定向、定大小,1定位： 一对引物分别位不同模板 DNA链上的靶序列的两端， 两条引物各自结合在不同 的信息、非信息链上。 引物是通过严格碱基互补发挥识别、 结合和特异定位。,2定向： DNA链有方向性从5端到3端，引物 结合也有方向性。 引物和模板DNA 3端结合， 以引物为起点的新合成链，5端锁定。 遵循DNA合成5端到3端的方向性， 引物只能3端延伸， 两条引物3端均指向靶序列。,在高温模板变性反应体系中，加入过量（浓度大，引物数量多）的一对引物，在较低温

5、下（25 - 50）大量的引物分别与各自相对应的单链模板DNA互补补严格大碱基配对，由于引物量大，长度小，其退火、结合的速度远高于模板单链DNA之间的结合。,3定大小 引物决定两条引物之间的靶序列长度，一对引物一旦设计合成，其扩产物长短不再变化。,（三）适温引物延伸（适温新链合成） 加入选定的DNA聚合酶，在其适宜温度（Taq 酶为65 - 72）进行DNA酶促合成反应，反应体系中的4dNTP（底物A、C、G、T四种核酸），在引物3端，在模板序列指导下，开始合成，即引物自53端延伸，合成一条与模板互补 之新链。,反应体系中DNA产量增加一倍，（原模板+新合成DNA，半保留复制），若以此产物DN

6、A总量为模板重新合成反应，新反应体系中模板量实际将增加一倍。,（四）循环指数扩增 重复前三个步骤， 由于每次循环后产物可作为下一次反应模板，DNA总量和模板量均较上一次循环增加一倍， 反复多次累积呈指数增加，如一分子DNA成单链后两个模板，一次循环后变为2分子DNA，变性后有4个单链模板，30次循环的 230呈百万倍增加。,PCR原理,模版,目的扩增片段,5,5,3,3,PCR原理,高温模板变性,目的扩增片段,3,3,5,5,PCR原理,2.降温引物退火,上游引物： 下游引物：,5,3,3,5,PCR原理,3.适温引物延伸,PCR原理,4.循环指数扩增,)高温模板变性,PCR原理,2)降温引物

7、退火,PCR原理,3)适温引物延伸,PCR原理,4)循环指数扩增,(1)高温模板变性,PCR原理,(2)降温引物退火,PCR原理,(4)循环指数扩增,(3)适温引物延伸,DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。,预变性(92-95C,2-5m),变性(92-95C,30s),复性 (40-60C,30s),延伸 (72C,30-60s),总延伸 (72C,7m),(25-35)次,PCR的一般过程：,经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。,PCR 循环 第一步 加热变性,靶序列,靶序列,Primer 1,Prim

8、er 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR 循环- 第二步 引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,Primer 1,Primer 2,Biotin,Biotin,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸,靶序列,靶序列,Biotin,Biotin,第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1

9、 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,30次循环后靶序列扩增的数量,PCR每次循环扩增一览表 (n0) 循环 起始模板 5端锁定长链 短链靶序列 总拷贝数 0 2 0 0 2 1 2 2 0 4 2 2 4 2 8 3 2 6 8 16 4 2 8 22 32 20 2 40 105 220+1 n 2 2n 2n+1-2n-2 2n

10、+1 (恒定不变) (线性增加)(近似指数增加) (指数增加),从表中可知， 20次PCR循环后，反应产物DNA链拷贝数220 起始模板可略去不计，5端长链数40个，只占总数40/2203.510-5.比例相当小。 当扩增30次后，其占比例更小，产物中 99.99%均为目的靶序列短链。 可能合成少量小于靶序列的短小片段。由于进入下一循环后，引物结合不止，不可能大量扩增。,(二)PCR操作流程,5、PCR反应参数的设定（选择与优化）,PCR反应体系,Mg2+,Mn2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA 多 聚 酶,Pfu DNA 多 聚 酶,引 物,和 或 和,* 切记莫忘

11、 模板变性要充分， 最好加酶前使模板充分变性 变性成单链 * PCR 反应六要素 引物 酶 dNTP 模板 Mg2+ 缓冲液,（四）结果检测（显示）,一般采用琼脂矿凝胶电泳-澳化乙锭处理紫外灯下观察法、荧光显示（PCR-EB法） 注意设立严格对照： DNA分子量标准， 阳性对照， 阴性、空白对照,更精确的方法： PCR-blot（转印后与已知探针、杂交） PCR-LP（产物标记后作探针、杂交） PCR-HPLC（分析吸收峰） 套式PCR（另设计一对内引物、扩增更小片段）,标记引物,观察,PCR产物,五、PCR两个最关键因素引物、酶,（一）引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性

12、取决于引物与模板DNA互补的程度。 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5端引物和3端引物，或称为上游/正向引物和下游/反向引物。 通常DNA及mRNA序列的写法为53，所以5端引物与目的序列的5末端序列相同，而3端引物与目的序列的3末端序列反向互补。,引物,它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有1518 bp。,* 如何设计PCR引物要素之一,（A）

13、引物来源： （1) 购买成套检测试剂盒，简单省力、 易出错、成本高 （2) 自己合成 1）查文献、查序列库（计算机） 直接查引物序列合成； 查靶序列自己设计 2）依PCR目的，选定靶序列上的两侧翼序列如 作检测，靶序列应保守、特异（种、属、 型特异）,3）必须有两条不同引物，扩增两条不同链，序列分析资料只能提供一个DNA链顺序。假定是信息链的资料。,5 P2 3 3 P1 5,信息链5 3， 已知该条信息链序列/靶序列资料： 5-TATAACATG AAG ACG AGC CAC/ CAG CGG/ CAC CGA CTC CAT TAACGTACG -3,必须据此序列置设两个引物： 扩增信息

14、链的引物 扩增其互补链的引物 ( 知道DNA一条链序列，可依硷基互补配对原则写出另一互补链序列 ）,（4）谁的引物合成谁的链，但必须以对方链为模板，产物中的两条新链，一条是信息链，另一条为与互补的非信息链。 （5）信息链引物的设计： 按信息链顺序，在5分端选定部位，按碱基排列顺序照抄10 - 20个碱基，即信息链引物。合成新的信息链。 信息链引物： P1 5ATGAAGACGAGCCAC（5 3）见图,（6）非信息链引物的设计 在信息链的 3端，选10 - 20碱基，写出其互补碱基，即为非信息链引物，将来以互补链为模板合成出新的非信息链，考虑到方向性。（5 3） 非信息链引物： P2 5TTAATGGAGTCGGTG3 即按5 3写出，（表面上与信息链顺序反向）,3 5P2 5TATAACATGAAGACGAGCCAC/CACCGACTCCAGTTAA3 3ATATTGTACTTCTGCTCGGTG/GTGGCTGAGGTAATT5 P1 5 3 P1 5ATGAAGA