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1、山 东 大 学 实 验 报 告 酵母菌的培养和形态观察 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1. 了解酵母培养基的特点以及酵母的培养方法。 2. 学习并掌握酵母制片方法，观察酵母的个体形态及死活细胞区分。 3. 学习掌握观察酵母的出芽生殖方式。 4. 学习掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 5. 学习和掌握酵母的菌落形态特征。 【实验原理】 1. 酵母菌 酵母菌形态：是多形的、不运动的单细胞真核微生物，细胞核与细 胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。 酵母菌繁殖：繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅 裂殖酵母属是以分裂方式繁殖； 有性生殖是通过质配、核配和减数分 裂而产生的子囊
2、孢子。 图 1. 典型酵母（酿酒酵母）生活史 山 东 大 学 实 验 报 告 2. 子囊孢子 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中， 能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。 酵母 菌形成子囊孢子需要一定的条件， 所以对不同种属的酵母要选择适合 形成子囊孢子的培养基。 麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 3. 美蓝染色 本实验通过美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。 美 蓝 为 无 毒性染料，其 氧 化 型 为 蓝 色，而还原型 为无色。用它 对 酵 母 菌 染 色时，由于活 细 胞 的 新 陈 代谢作用，使 细 胞 内 具 有 较强的还原
3、能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型， 所以 酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此 还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美 蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。 山 东 大 学 实 验 报 告 【实验材料】 1. 菌株 表 1. 菌株。 编码 菌株 拉丁文 1 普通酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae P1 2 安琪酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae A1 3 贝酵母 Saccharomyces bayanus 2. 培养基 表 2. 培养基配方 编码 培养基 1 麦芽汁培养基
4、麦芽汁：150mL 琼脂：3g pH 自然（约 6.4） 灭菌：1.05kg/cm2，20min 2 YEPD 培养基 酵母膏：1% 蛋白胨：2% 葡萄糖：2% pH：6.0 灭菌：121，15-20min 3 麦氏琼脂培养基 葡萄糖：1.0g 酵母浸出物：2.5g 乙酸钠：8.2g KCl：1.8g 蒸馏水：1000mL 琼脂：15-20g 灭菌：15 磅，15min 3. 实验试剂 表 3.实验试剂及其配方。 编码 试剂 配方 1 生理盐水 0.850.9%的氯化钠溶液 2 美蓝染液 将 0.5%的溶液稀释成0.1%吕氏碱性美蓝染液 3 水-碘溶液 将革兰氏染色中的卢戈氏碘液稀释 4 倍
5、4 芽孢染色液 5%孔雀绿、0.5 沙黄水溶液、95%乙醇脱色液 4. 其他 普通光学显微镜、吸水纸、载玻片、酒精灯、接种环等。 山 东 大 学 实 验 报 告 【实验步骤】 1. 麦芽汁培养基的配制 （1） 取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水 6-12 小时，置 15阴暗 处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸 长至麦粒的两倍时， 即停止发芽， 摊开晒干或烘干， 贮存备用。 （2） 将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在 65水浴中糖化 3-4 小 时，糖化程度可用碘滴定之。 （3） 将糖化液用 3-4 层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄 清，方法是将一个鸡蛋白加水约 20m
6、L，调匀至生泡沫为止，然 后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。 （4） 将滤液稀释到 5-6 波美度， pH 约 6.4， 加入 2%琼脂即成。 121 灭菌 30min。 2. 酵母菌的一般培养 将酵母菌 A 和酵母菌 B 分别利用分区划线方法接种到 YEPD 培养基 上，在 28-30恒温培养箱中，倒置培养 1-2 天。 图 2. 分区划线法示意图 起点 山 东 大 学 实 验 报 告 3. 酵母子囊孢子的诱导产生 （1） 菌体活化：将菌株分别接种到 YEPD 平板，28-30，倒置培养 1-2 天。连续传代 2-3 次，产生健壮和旺盛的活力细胞。 （2） 饥饿处理：取适量活力酵母菌细胞，用手
7、敲击使之在生理盐水 中做成均匀细胞悬液。 （3） 生孢诱导：取一滴或一接种环菌悬液滴在麦氏琼脂平板上，静 置几分钟， 使菌液浸入琼脂中， 不要旋转或者斡旋平板。 25， 培养 7 天。 4. 酵母菌制片与简单染色美蓝染液水浸片法 （1） 取干净载玻片，滴加一滴 0.1%吕氏美蓝染液于载玻片中央，无 菌操作取 YEPD 平板上 38-30培养 1-2 天的培养物适量， 涂抹 于染液中，做成分散的细胞悬液。 （2） 用镊子取一盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片 倾斜并覆盖在菌液上。 （3） 将制片放置约 3 分钟后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和 出芽情况，并根据细胞颜色区分死细胞和活
8、细胞。 （4） 染色 30 分钟后， 再次观察， 注意死活细胞的比例是否发生变化。 水-碘溶液水浸片步骤与美蓝水浸片制片方法相同。 5. 酵母子囊孢子染色孔雀绿染色法 （1） 取干净载玻片，滴加一滴蒸馏水，无菌操作取第 3 步诱导后培 养物适量，涂抹于水中，做成分散的细胞悬液，涂片干燥和加 热固定。 山 东 大 学 实 验 报 告 （2） 用 5%的孔雀绿染色 1-2 分钟，然后水洗； （3） 用 95%的乙醇脱色 30 秒，水洗； （4） 用 0.5%的番红水溶液复染 1-2 分钟，水洗，滤纸吸水，干燥。 （5） 镜检，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，最后用油镜观察。 【实验结果】 1. 酵
9、母的培养特征 酵母菌 A：米黄色，表面光滑湿润，凸起，边缘光滑近圆形，不 透明，发酵味道浓郁，单菌落大小不一，易挑起。 酵母菌 B：米黄色，表面光滑湿润，凸起，边缘光滑近圆形，不 透明，发酵味道浓郁，单菌落大小不一，易挑起。 图 3.酵母平板 图左是安琪酵母，图右是贝酵母。 2. 酵母细胞形态与出芽生殖 本实验通过美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。 0.1% 美蓝水浸片的观察结果如下。 山 东 大 学 实 验 报 告 图 4. 安琪酵母美蓝染色结果（10*40 倍） 图 4 中是安琪酵母 0.1%美蓝染色 3min 和染色 30min 后细胞存活 数量的对比图。A 是美蓝染色 3
10、min 后安琪酵母死活细胞的状态，C 是 A 的局部放大图。B 是美蓝染色 30min 后安琪酵母死活细胞的状 态，D 是 B 的局部放大图。 通过图 4 中 C 和 D 我们可以看到，与 3min 相比，将美蓝染色水 浸片放置 30min 后，视野中蓝色和淡蓝色的细胞数量明显增加，说 明死细胞的比例增加。 山 东 大 学 实 验 报 告 图 5. 贝酵母美蓝染色结果（10*40 倍） 图 5 中是贝酵母 0.1%美蓝染色 3min 和染色 30min 后细胞存活数 量的对比图。A 是美蓝染色 3min 后安琪酵母死活细胞的状态，C 是 A 的局部放大图。B 是美蓝染色 30min 后安琪酵母
11、死活细胞的状 态，D 是 B 的局部放大图。 通过图 5 中 C 和 D 我们可以看到，与 3min 相比，将美蓝染色水 浸片放置 30min 后，视野中蓝色和淡蓝色的细胞数量明显增加，说 明死细胞的比例增加。 山 东 大 学 实 验 报 告 图 6. 酵母美蓝染色结果（10*100 倍） 图 6 中是酵母 0.1%美蓝染色结果。图 A 是安琪酵母染色结果，图 B 是贝酵母染色结果。 通过图 6，我们可以观察到安琪酵母细胞为圆形、椭圆形，出芽 生殖。贝酵母圆形或近圆形，出芽生殖。 3. 酵母细胞和子囊孢子 本实验通过孔雀绿来观察生活的子囊孢子。 孔雀绿的观察结果如下。 图 7. 酵母孔雀绿染色
12、结果（10*100 倍） 图 7 中是酵母孔雀绿染色结果。 图 A 是安琪酵母染色结果， 图 B 是 贝酵母染色结果。 红色部分是酵母细胞， 绿色部分是子囊及子囊孢子。 山 东 大 学 实 验 报 告 贝酵母的子囊及子囊孢子数目占总细胞的比例较大。 【分析与讨论 】 注意事项： 1. 用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免损坏细胞。 2. 滴加染液要适当， 否则用盖玻片覆盖时， 染液过多会溢出， 过少会 产生大量气泡。 3. 盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。 分析讨论： 1. 根据观察， 吕氏碱性美蓝染液作用时间与酵母菌死、 活细胞比例变 化是否有关系？ 有关系， 时间越长则视野中死亡酵母菌所占比例就越大。 因为酵母 菌处于吕氏碱性美蓝染液中会脱水， 导致死亡， 时间越长， 细胞死 亡数量就越多。
