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1、1 玻璃刀玻璃刀 (glass knife) 與刀口水槽與刀口水槽 (trough) 製作製作 玻璃刀需於切片當天製作，請於切片當天預留 0.5-1 h。 方法步驟： 1) 首先取一乾淨的玻璃條，粗造面朝下 (由玻璃條側面觀之)。利用製刀機將玻璃條 (glass strip) 切割成一英吋大小的 正方形，再由對角線 (約略偏斜) 切割一裂痕，自兩側及底部加壓使玻璃斷裂為二即成。理想的刀口應呈現平整均勻， 在解剖顯微鏡下無鋸齒狀缺刻 (圖 1.5.1)。 施加壓力於經鑽石刀劃過的玻璃條時，需慢慢的添加壓力。當切口出現一半月型的陰影或白影 (視觀察角度而定) 時，即停止繼續增加壓力，使切口自行持續
2、擴大至斷裂。經此過程做出的玻璃刀有較佳的品質。 圖 1.5.1 玻璃刀的製作 (A) LKB700 製刀機。(B) 利用製刀機上的鑽石刀在玻璃條上略做切割。(C) 旋轉製刀機右側旋鈕，自玻璃條 兩側及下方均勻施加壓力，使其斷裂。(D) 及 (E) 每一正方形玻璃條可製作 2 把玻璃刀，每把刀各自有刀鋒及 刀座。第一把刀的刀鋒恰好緊鄰第二把刀的刀座。 (F) 製作完成的玻璃刀可以在顯微鏡下檢查刀鋒部分，理想 的刀鋒應為平滑無缺刻。整把刀最適合切片的部分為 Z 區，約佔 1/3；S 區不用於切片；而 E 區的使用需視刀 鋒的品質而定。 (圖片 A-C, E 取自生物電子顯微鏡學, 圖片 D, F
3、取自 Methods of Preparation for Electron Microscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences) 2) 將銀膠帶的一端貼於刀口下方並與底部平行後，另一端圍繞成一平滑的弧形貼於另一側，圈出一船型水槽。過程中勿 用手接觸用以形成水槽，帶有黏性的膠帶面，以免將手上的油脂黏於其上 (圖 1.5.2 A-B)。 3) 以刀片沿玻璃將多餘的膠帶切除，然後於水槽下緣與玻璃刀接觸面以蠟或指甲油封合，避免水滲漏 (圖 1.5.2 C)，待 乾燥後即可使用。 圖 1.5.2 刀口水槽的製 (圖片取自生物電子顯微鏡學) 2
4、、樣品塊修整樣品塊修整 (trimming) 包埋完成後的樣品塊須先經過修整，將樣品塊尖端修整成適當的大小及形狀,並將要觀察的部份露出。習慣上將樣品塊修整 成平頂的金字塔型 (從側面觀察)，頂部與底部略成梯形 (從上方觀察)，大小應小於 0.5 mm，金字塔高度不宜超過 0.2 mm。 將樣品塊修整成平頂的金字塔型，是為了讓樣品在切片過程中得到最佳的支持力。高度過大，切片時容易發生震動，在切 片上留下深淺交替的平行條紋，或導致樣品塊前端斷裂。 較小的樣品塊切面較容易進行超薄切片，但過小的切片在電子顯微鏡下可觀察到的東西較少。 方法步驟： 1) 將樣品塊放置在解剖顯微鏡下，以刀片 (two-ed
5、ged razor blade) 水平的削去尖端直到組織露出 (圖 1.4.1, 步驟 1)。 2) 修出梯形的上下底。先將刀片以垂直方向切下，再將刀鋒以水平朝向自己的方式緩慢前進，至前一刀垂直切下處即可除去 不要的部份 (圖 1.4.1, 步驟 2-3)。注意力量的控制。 3) 修出梯形的兩邊，方式同上 (圖 1.4.1, 步驟 4-5)。 4) 待初步形狀出來後， 換一新刀片再做更細微的修整， 盡量使上下底平行， 切面光滑無缺刻。 此步驟會影響連續切片 (ribbon) 的形成。 圖 1.4.1 樣品塊修整 (圖片取自 Methods of Preparation for Electron
6、 Microscopy) 3、半薄切片（半薄切片（1-2um)、光学显微镜定位、光学显微镜定位 4、刀槽及液面的调节刀槽及液面的调节 超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、 伸展和捞取， 为此在刀口背部装上一个小的水容器， 通常称为“刀 槽”。通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段医用橡皮胶缠绕过刀背，紧紧地粘在玻璃上，橡皮胶的后下部分用融化的牙科用红腊 密封，以防漏水。注意橡皮胶的顶端不应高出刀刃。切片前在刀槽内加入双蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。液面的调节一般先 加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。然后在双筒解剖镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面
7、 变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面。从这一光亮的反射光可看到切出的片子。在切片过程中由于液体蒸发，需加 液以保证正确的液面。 5、 超薄切片超薄切片 切片时将夹着修好组织块的样品夹安装在切片机的样品臂上，刀台上装好玻璃刀，其高度要与刀台上的标准规等高，后斜角一 般在 35 ，在显微镜下使样品块面的上下两条平行边与刀刃平行，如是梯形的应长边在下面。调整好刀刃和组织块的距离，再在 刀槽内注入适量的双蒸馏水。将切速放在 25mm秒，调节控制切片厚度的电流表，即可切片。当切片停止时，立即打开电吹 风，冷却样品臂。捞片后关掉电吹风又可重新切片，或更换新刀。 切片厚度的判断。一般是利用反射光
8、干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和从切片下面的水面的反射光发生干涉 现象（见下表） 。当用白光时，从双筒显微镜下观察两种光线间的差别。 目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色的近似值 干涉色 切片厚度 暗灰色 40nm 以下 灰色 4050nm 银白色 5070nm 金黄色 7090nm 紫色 90nm 以上 紫色切片太厚，电子束不易穿过，故不适用于电镜观察用。金黄色切片其分辨率也比较低。目前一般认为银白色的切片是较 理想的厚度，其分辨率可达 2.5nm 左右。也有人喜欢采用金黄色切片，尤其在细胞化学、放射自显影中较适宜。 切片的展平和捞取。在切削过程中，由于切片很薄，经挤压使切片发皱
9、，甚至引起标本结构变形。为此，常用沾有氯仿或二 甲苯的滤纸小片移近刀槽液面，试剂挥发性蒸汽可使切片软化伸展。蒸发时间 23 秒钟即可，不能把试剂滴入水槽。 捞片时，可用眼睫毛做成的小针把切片轻轻地拨离刀刃，并按需要把切片带分成几段。再用弯头的小镊子夹住铜网的边缘， 有支持膜的一面向下，与切片轻轻接触，使切片贴附在铜网的膜上，轻轻提起并把膜面朝上，放于培养皿中无毛的滤纸上，待干经 染色后即可电镜观察。 方法步驟方法步驟： 1) 將標本臂 (specimen arm) 及刀座 (knife holder) 退回起點。 標本臂的控制懸鈕位於切片機右後側面，退標本臂至底時先以順時鐘方向旋轉至底，再以反
10、方向倒轉半圈。 2) 選用適當的固定座將樣品塊固定於標本臂上，加以旋緊。略為調整樣品塊的角度 (圖 1.6.2 中 3,4)，使樣品塊整個切 面與即將放置的刀口等距平行。緊量使其在固定過程中勿大力震動標本臂，以免影響儀器準確度。 3) 將玻璃刀安置在刀座上，調整適當的高度與位置，並加以旋緊 固定不良的樣品塊與玻璃刀可能在切片上造成 chatter 的現象。 4) 調整玻璃刀的傾斜角度 (clearance angle) 為 4 (圖 1.6.3 中 7)。 此角度視包埋劑與刀子種類的不同而改變，但一般都在 25 間。 5) 鬆開刀座，以手動方式逐漸前移刀座，至刀口靠進樣品塊時鎖緊刀座 (圖 1
11、.6.3 中 1 左扳時可用手扶住整個刀座，慢 慢向前推進。右扳時可固定鎖緊刀座)。 1 6 7 8 9 9 9 圖 1.6.3 Richert-jung Ultracut E 超薄切片機刀座 圖上各部位說明：(1) 刀座固定-右扳可固定刀座。 (6) 鎖緊玻璃刀於刀座上。(7) 調整玻璃刀的傾斜角度 (clearance angle)。(8) 在 1 右扳情況下，順時鐘方向旋轉可前進刀座；逆時鐘方向旋轉可後退刀座 (圖片取 自生物電子顯微鏡學)。(9) 左右調整刀座角度。 6) 利用注射針筒在水槽中加蒸餾水，加至水面在顯微鏡下剛好呈一均勻亮面 (圖 1.6.4 C)。 不正確的水面高度可由水
12、槽中出現黑影得知。水面過低時，多在刀口附近水面形成黑色弧線，此時剛切出的切片 可能黏附在刀口上，並擠壓皺縮 (圖 1.6.4 A)。 水面過高時，水面變得灰暗，可能導致樣品塊沾溼，剛切出的切片被拖離水槽 (圖 1.6.4 B)。 圖 1.6.4 刀口水槽的水面高度與切片的關係 (圖片取自 Principles and Techniques of Electron Microscopy, Biological Applications Volume 1) 7) 將玻璃刀朝樣品塊逼近，至快接近時停止，需小心勿使兩者碰撞 (圖 1.6.3 中 8)。 8) 選擇修平樣品塊切面與切厚切片所用的刀鋒 (
13、圖 1.6.1)。 9) 在顯微鏡下調整玻璃刀刀鋒與樣品塊的距離與角度 (圖 1.6.5)。此部分難度較高，利用反射的亮帶判斷距離需經驗和 適當光源的配合。需小心勿使刀鋒超過樣品塊平面，否則整個梯形都可能斷裂。 使樣品塊梯形的上下底與刀口平行：梯形切面上下底與刀口不平行時，旋轉樣品塊使之平行 (圖 1.6.2 中 3,4)。 使樣品塊整個梯形平面與刀口等距：(1) 水平面等距樣品塊切面上之光帶兩端寬度不一時，代表刀口與樣品面 互相歪斜，旋轉刀座，使光帶寬度一致 (圖 1.6.3 中 9)。(2) 垂直面等距樣品塊切面上之光帶寬度會隨標本臂 上下而改變，代表梯形之上下底與刀口距離不同，旋轉樣品塊
14、角度，使光帶寬度一致 (圖 1.6.2 中 3,4)。 圖 1.6.5 刀口與組織切面的調整 A 樣品塊整個梯形平面與刀口保持垂直面等距 。B 樣品塊整個梯形平面與刀口保持水平面等距 。C 樣品塊梯形 的上下底與刀口平行。(圖片取自 Methods of Preparation for Electron Microscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences) 10) 調整切片速度為 3 mm/sec 及 semisection 切片厚度 1 m ，在進行超薄切片(ultrasection)前需先進行厚片 (semisection) 的觀
15、察及樣品塊切面的微修整。 11) 調整標本臂開始切片的起始位置 (樣品塊略低於刀鋒)。極重要，若無法確定，請一定要請教有經驗的老師。 12) 開始切厚片，待切出一平面時，可以單面削平的竹籤撈起觀察。方式如下：在玻片上滴一滴水，以撈起切片的竹籤尖 端接觸玻片上的水後， 將玻片放置在5560 加熱板上待其乾燥。 滴一滴toluidine blue在切片上， 同樣在5560 加熱板上加熱約 30 sec (此時染劑邊緣會出現金色光澤)，再以洗瓶沖洗掉過多的染劑後放回加熱板，當玻片乾燥後 即可放在顯微鏡下觀察。 13) 在厚片上已切到所欲觀察的目標，且已切出完整的切面時，即可開始切超薄切片。調整切片速
16、度為 3 mm/sec 及 ultrasection 切片厚度為 7090 nm。做免疫電顯實驗的切片須較厚，可定為 99 nm。 14) 觀察刀鋒是否有毀損。若有，須將刀座稍微退離樣品塊(圖 1.6.3 中 8) 後換一刀鋒，並重新對刀，方法同步驟 7-9。 15) 切出來的切片在顯微鏡下應呈銀白色 (6090 nm) 至金黃色 (90150 nm)，直線前進的連續切片帶 (ribbon)。 做免疫電顯實驗的切片應呈金黃色。 14) 待切出適當長度的切片帶後停止切片。以尖端黏有眉毛的竹籤輕划水面，將切片待趕至水槽深處，並以眉毛筆輕觸切 片帶邊緣缺刻部位，使切片帶斷至適當長度 (約 5, 6 片)。 15) 以鑷子夾取鎳網 (Ni grid，免疫電顯實驗需用鎳網) 邊緣來撈取切片。撈取切片的方式有二：(1)將鎳網欲接觸切片 的那一面朝上傾斜進入水中，以上緣接觸第一片切片後緩緩拉起。(2) 將鎳網欲接觸切片的那
