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1、LifeTech Real-Time PCR 技术原理以及应用技术原理以及应用 2 AB定量定量PCR发展史发展史 1996，世界上第一台定量，世界上第一台定量PCR7700 1997， ，5700 2000，金标准，金标准7900 2003， ，AB获得荧光定量获得荧光定量PCR仪器专利仪器专利 2001， ，7000 2004， ，7300 & 7500 2007，第四代产品，第四代产品StepOne & StepOnePlus 2010， ， ViiA 7 2011， ， QuantStudio 12K 3 AB拥有的拥有的Real-Time PCR相关的知识产权相关的知识产权 PCR仪
2、器专利 定量PCR仪器专利 VIC dye TaqMan MGB探针 4 目前目前AB定量定量PCR仪产品线仪产品线 Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne & StepOnePlus Real-Tim
3、e PCR System 5 ViiA 7 Applied Biosystems ViiA 7 Real- Time PCR System 6 QuantStudio 7 Real-Time PCR Technology Principle 起点定量与终点定量起点定量与终点定量 相同样品进行96次扩增，由于PCR扩增效率的差异，扩增结果存在很大的差异 8 PCR动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 9 荧光定量PCR数学原理荧光定量PCR数学原理 基线阈值Ct值DNA基线阈值Ct值DNA0 0 10 线性图谱对
4、数图谱 基线基线阈值阈值Ct值值DNA0 什么是基线？ 基线就是扩增曲线中的水平部分。基线就是扩增曲线中的水平部分。 11 基线基线阈值阈值Ct值值DNA0 什么是阈值？ 1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于105。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。 12 基线阈值基线阈值Ct值值DNA0 什么是CT值？ 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次
5、数 CT值 线性图谱 CT值 对数图谱 13 为什么CT值 DNA0 ？ N = N0x (1+e)n N：产物分子数；：产物分子数；N0：起始分子数：起始分子数 e： 扩增效率；： 扩增效率；n:循环次数循环次数 lg DNA 循环数 线性期线性期 y = x(1+e)n指数期指数期 PCR理论方程只在指数期成立 14 为什么为什么CT值 值 DNA0 ？ Rn= RB+ X0(1+ e)n Rs 第第n次次PCR循环时的荧光信号强度循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度等于背景信号强度(RB)加上每个分 子的荧光强度 加上每个分 子的荧光强度(即单位荧光强度，即单位荧光强度，RS)与
6、分子数目的乘积。与分子数目的乘积。 设n=CT，则： RCT= RB+ X0(1+ e)CT Rs log (RCT - RB) = log X0 + CT log (1+ e) + log Rs CT log (1+ e) = - log X0 + log (RCT - RB) log Rs )1log( log)log( )1log( log X SBT X O T E RRR E X C 即CT = - k lg X0+ b（线性方程） 15 标准曲线：标准曲线：CT值对值对DNA0作图作图 CT值 lg 起始DNA CT = - k lgX0+ b 16 成功的定量PCR成功的定量PC
7、R 17 定量PCR的化学原理定量PCR的化学原理 常用的荧光标记方法常用的荧光标记方法 DNA双链染料双链染料 SYBR Green 、LC Green、Cyto9、Evagreen 序列特异性探针序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons（分子信标） Dual Probes (FRET) 18 荧光标记方法的原理荧光标记方法的原理 探针 TaqMan TaqMan MGB 染料 SYBR Green I 19 SYBR Green 染料 20 SYBR Green 作用机理 21 熔解曲线(Dissociation curve) Tm值：50%DNA变成单链时的温度，
8、此温度与双链DNA的长度、GC含量有关， 可部分代表序列的特异性 PCR过程中，控制温度缓慢升高 ，双链DNA解链成为单链DNA，SYBR Green 被释放，荧光信号减弱 对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即Tm. 22 熔解曲线(Dissociation curve) 导数图谱 原始图谱 导数图谱 原始图谱 只有染料法才需要做融解曲线，探针法没必要只有染料法才需要做融解曲线，探针法没必要 23 特异性的熔解曲线 24 SYBR Green 优缺点 成本低成本低 不需要探针不需要探针 灵敏度高灵敏度高 Power SYBR能检测2个拷贝起始模板Power SYBR能检测2个拷贝起
9、始模板 适合初步筛查适合初步筛查 先SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法精确定量先SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法精确定量 兼容熔解曲线兼容熔解曲线 鉴定PCR杂带、引物二聚体鉴定PCR杂带、引物二聚体 特异性问题特异性问题 不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号 多重定量问题多重定量问题 每孔只能定量一个基因每孔只能定量一个基因 25 TaqMan-水解型杂交探针 与目标序列互补 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q
10、基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 26 27 TaqMan探针法的特点TaqMan探针法的特点 基于引物和探针的特异性，探针与目标之间的特异 杂交产生荧光信号 提供多重基因检测功能和突变检测 优化可用的实验分析方法 28 TaqMan MGB探针 NFQMGBR 报告荧光无荧光淬灭基团小沟结合物 GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC AGGCCTTGAGAGATAT R | Q AGGCCTTGAGAGATAT R Q (non-fluorescent quencher)NFQ Q MGB (minor groove binder) 提高探针Tm值 29
11、 TaqMan MGB探针探针 FAM MGB 完全配对，有信号 FAMMGB 一个碱基不配对，没有信号 分辨1个碱基的精确度 R Q MGB NFQ 53 30 TaqMan-MGB探针优点TaqMan-MGB探针优点 减少背景减少背景 淬灭基团没有荧光淬灭基团没有荧光 提高信噪比提高信噪比 即使报告信号强度不变即使报告信号强度不变 提高淬灭效率提高淬灭效率 减少背景减少背景 淬灭基团没有荧光淬灭基团没有荧光 提高信噪比提高信噪比 即使报告信号强度不变即使报告信号强度不变 提高淬灭效率提高淬灭效率 提高探针Tm值提高探针Tm值 长15碱基，提高 18C长15碱基，提高 18C 缩短探针长度缩
12、短探针长度 最佳范围13-21 碱基最佳范围13-21 碱基 定量更多基因定量更多基因 提高探针Tm值提高探针Tm值 长15碱基，提高 18C长15碱基，提高 18C 缩短探针长度缩短探针长度 最佳范围13-21 碱基最佳范围13-21 碱基 定量更多基因定量更多基因 31 Real-Time PCR Technology Application 绝对定量绝对定量(Absolute Quantification) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量相对定量(Relative Quantification) 基因在不同组织中的表达差异15个物种，120万个试剂盒 miRNA研究1
13、000多个试剂盒 CNV研究超过160万个TaqMan Copy Numer Assay 药物疗效考核 蛋白表达研究（PLA） 突变分型突变分型(Allelic Discrimination) 基因突变分析 SNP研究超过450万个分型试剂盒 物种鉴定、菌株鉴定 阴阳性检验阴阳性检验(Plus/Minus with IPC) 高分辨融解曲线高分辨融解曲线(High Resolution Melting) 32 荧光荧光PCR配套试剂配套试剂 Master Mixes TaqManUniversal PCR Master Mix TaqManFast Universal PCR Master Mix Power SYBRGreen Master Mix Fast SYBRGreen Master Mix TaqManGene Expression Master Mix TaqManGenotyping Master Mix TaqManEnvironmental Master Mix TaqManGene Expression Assays: 1,200,000 TaqManSNP Genotyping Assays: 4,500,000 Custom Primers & Probes Questions? Thank you for your attention!
