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1、实验一 凯氏定氮法测定蛋白质含量,凯氏定氮法 是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法,【目的】 了解凯氏定氮法测定蛋白质含量的方法、意义及应用,【原理】 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量计算出氮的含量，然后乘
2、以相应的换算系数，即得蛋白质的含量。,1.有机物中的铵根在强热和催化剂及浓H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4，反应式为：,2NH2+H2S04+2H+(NH4)2S04,（其中CuSO4做催化剂）,2.在凯氏定氮仪器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3 溶液中，反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O,3. 用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算系数，即得蛋白质的含量，反应式为： (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H
3、3BO3,【操作步骤】,基本步骤如下：取样消化蒸馏滴定计算,称取适量样品（约相当氮30mg40mg）,移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml浓硫酸，置于消化炉上小心加热， 待内容物全部炭化，泡沫完全消失后，加大火力，并保持管内液体内微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续0.5h1h。取下放冷待蒸馏用。 （建议：消化炉温控时间及温度：1阶段选择温度范围280左右，时间为20分钟左右； 2阶段选择温度范围450左右，待颜色变蓝绿色后继续加热0.5h1h。,1.样品消化,NaOH、H2O注入管口，用橡胶管套如后分别置于NaOH、H2O盛器桶内，加液时按面板上相应开关，液体经电磁
4、泵自动流入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定。,2.蒸馏,蒸馏过程： （1）观察蒸发炉内水位，不能超过不锈钢电极（如果超过，要先排完水）。 （2）关掉排水阀，打开加热电源，打开冷却水（自来水开关），打开绿色蒸汽开关（只需打开任意一组），然后，观察电流表；等电流表升到4A左右，关掉蒸汽开关。待其回到0A后再打开蒸汽开关。电流升到4A后再关掉，这样反复开关（0-10）左右直到蒸汽从塑料管内喷出，让其喷半分钟左右，关掉蒸汽开关，仪器进入正常的待机状态。,（3）250ml三角接收瓶中加入2% H3BO3 50ml和23滴混合指示剂，将接收瓶套在蒸馏器的接收管上，并且让管口浸没在H3BO3溶液中。,
5、（4）把需要蒸馏的消化管固定在蒸馏器托物架上，然后按面板上NaOH、H2O开关，分别向消化管注入蒸馏水（10ml左右）及NaOH溶液（硫酸用量的5倍,约100ml），然后开启蒸汽开关，向试管内注入蒸汽、进行蒸馏。 待接收瓶内液面高于150ml时将接收瓶下移，使接收管离开液面、用少量H2O冲洗出气口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。 甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇配溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色。,用0.05mol/LHCl滴定接收瓶内的溶液，滴定至(暗)灰色时为止，记下消耗HCL的毫升数。,3. 滴定,按下列式子计算蛋白含量：,X样品中蛋白质的含量，% V1样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； V2试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； N硫酸或盐酸标准溶液当量浓度； 0.0141N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m样品的质量（体积），g（ml）； F蛋白质系数，按16%计算乘以6.25即为蛋白质。,【结果及计算】,式中：,测定范围：含氮在0.1200mg 测定品种：粮食、饲料、食品、乳制品、饮料、土壤、水、药物、沉淀物和化学品等。,加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。,混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。,
