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1、第1讲 微生物的培养与应用1(2019广西桂林调研)有机磷农药是用于防治植物病虫害的含磷有机化合物，广泛应用于农业生产中，有时会造成瓜果蔬菜等食品农药残留超标，不少品种对人、畜的毒性很强，人误食后如不及时医治就会危及生命。某班同学欲从土壤中分离高效降解有机磷农药的微生物。请回答下列问题：(1)为了获得能降解有机磷农药的微生物菌种，可在被有机磷农药污染的土壤中取样，并在含有碳源、氮源及_等的选择培养基上添加_进行选择培养。(2)将获得的3种待选微生物菌种甲、乙、丙分别接种在1 L含20 mg有机磷农药的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观察实验开始到微生物停止生长所用的时间
2、，甲、乙、丙分别为32小时、45小时、16小时，则应选择微生物_(填“甲”“乙”或“丙”)作为菌种进行后续培养，理由是_。(3)制备固体培养基的基本步骤是计算_溶化分装加棉塞包扎_倒平板。(4)若要测定培养液中选定菌种的菌体数，既可在显微镜下用_直接计数，也可选用_法统计活菌数目。解析：(1)微生物生存所需要的营养包括水、无机盐、碳源和氮源。因筛选降解有机磷农药的微生物，培养基中需添加适量的有机磷农药。(2)微生物可从降解的有机磷农药中获得特殊营养，丙生长时间短，说明其对有机磷农药的降解速度较快。(3)制备固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、分装、加棉塞、包扎、高压蒸汽灭菌、倒平板。(4)
3、菌体数量可通过显微镜利用血细胞计数板直接计数，也可以利用稀释涂布平板法统计活菌数量。答案：(1)水和无机盐有机磷农药(2)丙微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强(3)称量高压蒸汽灭菌(4)血细胞计数板稀释涂布平板2(2019四川绵阳诊断)水中细菌总数可以作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1 mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，经37 、24 h培养后，所生长出的菌落数。为初步测定某处池水中的细菌数目，实验的大致流程为：水样采集梯度稀释接种培养菌落计数。回答下列问题：(1)对采集的池水进行梯度稀释时，应先将1 mL水样加入_中以获得稀释10倍的稀释液。实验
4、中对采集的池水要进行稀释的目的是_。(2)接种培养所用到的培养基中，能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是_。(3)为保证菌落计数结果准确，一般选择菌落数在_的平板进行计数。用这种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低，原因是_。(4)实验过程中为确保培养基上菌落来自所采集水样，避免杂菌污染。实验中需要注意的具体操作有_(至少答2点)。解析：(1)对池水进行稀释时，为了减少误差，所用水必须为无菌水，1 mL水样稀释10倍，则需要加9 mL无菌水；池水中细菌数目过多，在进行涂布培养时不容易获得单个菌落，使计数误差较大。(2)稀释后的水样接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中培养，牛肉膏、蛋白胨均含有有机氮
5、、糖类等有机物，故能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是牛肉膏、蛋白胨。(3)为保证菌落计数结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。用稀释涂布平板法计数所得菌落数一般都会偏低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(4)为避免杂菌污染，具体操作时必须严格按照无菌操作的要求进行：实验者、操作台要进行消毒处理；所用容器均需灭菌；整个实验过程需要在酒精灯火焰旁进行等。答案：(1)9 mL无菌水避免池水中细菌数目过多(密度过大)，得不到单菌落(2)牛肉膏、蛋白胨(3)30300当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 (4)采集水样的容器要灭菌，稀释和接种
6、要在酒精灯火焰旁等3土壤中有些细菌含有可降解尿素的脲酶。如下是某同学从土壤中筛选能降解尿素的菌株的实验流程。请回答相关问题：配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养菌落计数(1)用以_为唯一氮源的培养基筛选能分泌脲酶的细菌。从功能上讲，该培养基属于_培养基。为了防止杂菌污染，培养细菌时必须在_条件下进行。(2)采用_法接种时需要将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养、菌落计数。在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在_旁进行操作。将接种后的培养皿置于37 恒温箱中倒置培养，将平板倒置的目的是_。(3)向培养基中加入酚红指示剂，若培养基中存在可合成脲酶的细菌，其菌落周围会出现红色，这是尿素被分解产生的_使
7、酚红指示剂显色的结果。变色区域越大，表明该菌株降解尿素的能力_。解析：(1)欲筛选出能降解尿素的菌株，配制培养基时应以尿素为唯一氮源，这样不能降解尿素的细菌在此培养基上就不能生存，这类培养基属于选择培养基。培养细菌时必须保证无菌操作。(2)在统计菌落数目时，常用的接种方法是稀释涂布平板法，整个实验操作过程都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。将平板倒置的目的是防止培养过程中培养皿盖上的冷凝水滴落在培养基表面，造成杂菌污染。(3)酚红指示剂变红的原因是细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，而氨使培养基的碱性增强，pH升高。降解尿素能力越强的菌株，在菌落周围形成的红色环带越大。答案：(1)尿
8、素选择无菌(2)稀释涂布平板酒精灯火焰防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染(3)氨(NH3)越强4回答与微生物实验室培养有关的问题：(1)在制备固体培养基时需加入的常用凝固剂是_。若培养基需调节pH，则应在灭菌之_(填“前”或“后”)调节。(2)为防止外来杂菌入侵，对_等可采用干热灭菌法进行灭菌。(3)右图为平板划线法接种后的示意图。在划线接种的整个操作过程中，对接种环至少需进行_次灼烧灭菌。接种后盖上皿盖，将平板_放入恒温箱中培养，这样放置的目的是_。(4)用稀释涂布平板法统计活菌数目时，每隔一个“时间间隔”统计一次菌落数目，最后选取_作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏菌落的数
9、目。解析：(1)制备固体培养基通常加入的凝固剂是琼脂。培养基若在灭菌后调pH，可能会造成培养基的污染，故培养基调pH应在灭菌前进行。(2)灭菌的方法通常有高压蒸汽灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌三种。采用干热灭菌的通常有玻璃和金属用具。(3)平板划线接种过程中需在接种前、每次划线后对接种环灼烧灭菌。图中共接种5个区域，故接种环至少需要进行6次灼烧灭菌处理。微生物培养过程中，易产生冷凝水，为防止水珠滴在培养基表面影响微生物生长，培养时需将培养基倒置。(4)用稀释涂布平板法统计活菌数目时，要以菌落数目稳定时的记录为最终结果，这样可以防止因遗漏而导致统计结果偏小。答案：(1)琼脂前(2)玻璃器皿和金属用具(
10、3)6倒置避免培养基被污染和防止培养基水分过快挥发(4)菌落数目稳定时的记录5某研究小组从牛的瘤胃中采集样本，进行分解尿素的微生物的分离与计数。实验基本步骤如下：请回答：(1)分解尿素的微生物能合成_，因此，配制培养基时以尿素作为唯一氮源，尿素会被分解成_使培养基的碱性增强。(2)配制培养基时，需添加琼脂，琼脂起_作用；培养基中添加 _作为指示剂，可使目标菌落的周围产生红色环带。(3)对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。 A高压蒸汽B干热C添加抗生素D过滤E紫外线照射F70%酒精浸泡(4)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后将1 mL瘤胃样液稀
11、释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为49、47和45。据此可得出每升瘤胃样液中分解尿素的微生物活菌数为_，理论上，统计的菌落数往往_(填“低”“等”或“高”)于接种的实际活菌数目。解析：将1 mL瘤胃样液稀释1 000倍，在3个平板上分别接入0.1 mL，经培养后3个平板菌落的平均数是(494745)347，则每升瘤胃样液中分解尿素的微生物活菌数为470.11 0001 0004.7108。答案：(1)脲酶(分解尿素的酶)氨(NH3)(2)凝固剂酚红(3)D(4)检测培养基平板灭菌是否合格4.7108低6金黄色葡萄球菌具有高度耐盐
12、性，在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。下面是某研究小组测定自来水中金黄色葡萄球菌浓度的实验操作。请回答下列问题：(1)金黄色葡萄球菌的培养基为7.5% NaCl牛肉膏蛋白胨培养基，此培养基能为金黄色葡萄球菌的生长提供_及水和无机盐。培养基中加入7.5% NaCl利于金黄色葡萄球菌的筛选，原因是_。(2)上述培养基的灭菌方法是_。在制作血平板时需等平板冷却后，方可加入血液，以防止_。血平板在使用前，需置于恒温培养箱中一段时间的目的是_。(3)取10 mL自来水样，加入_ mL无菌水稀释成101稀释自来水样，依次操作，制作102、103、104稀释自来水样
13、。(4)将0.1 mL 101104的四个稀释样液，分别接种到4组(每组3个)血平板上的方法是_。在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落的周围会出现_。若在103组的3个血平板上，金黄色葡萄球菌菌落数分别为39、38和37，则每升自来水中的活菌数约为_个。解析：(1)7.5% NaCl牛肉膏蛋白胨培养基可为金黄色葡萄球菌的生长提供碳源、氮源及水和无机盐。金黄色葡萄球菌具有高度耐盐性，培养基中加入7.5%的NaCl，在不影响金黄色葡萄球菌生长的同时可抑制其他菌的生长，因此有利于金黄色葡萄球菌的筛选。(2)通常采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。高温会破坏血细胞，因此为了防止血细胞被破坏，在制作血平板时需等平板冷却后，方可加入血液。血平板在使用前，需置于恒温培养箱中一段时间的目的是检测血平板是否符合无菌要求。(3)取10 mL自来水样，加入90 mL无菌水稀释成101稀释自来水样，依次操作，制作102、103、104稀释自来水样。(4)将稀释的样液接种到血平板上对微生物进行纯化培养，所采用的接种方法是稀释涂布平板法。金黄色葡萄球菌可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色，所以在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落的周围会出现透明圈(溶血圈)。由题意可知，血平板上生长的平均菌落数(393837)338个，则1 m
