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1、第六章 加压液相柱色谱分离制备技术,根据制备型分离中所用压力的大小，可分为列几种色谱方法： 一、快速色谱 约2bar/30psi 二、低压液相色谱 20bar/300psi (1 bar 105Pa = 100kPa = 760mmHg) 低、中、高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叉，只是为了区分方便，才如此划分。,第一节 快速柱层析 （FCC法） （Flash Column Chromatography ）,应用普通柱分离法解决了所制备化合物不能用重结晶、分馏、蒸馏等方法分离纯化的问题。 然而传统的柱分离往往是非常耗时，当样品1g or 2g，一天、两天、一星期是经常的。同时伴随着t增长
2、， 造成拖尾现象而收率降低； 敏感的化合物易分解。,FCC特点,快速柱层析（FCC）可克服普通柱分离的缺陷，它具有快速省时、分离效率高、简单易行的优点，所以国内外实验室基本都倾向于用此法。 对于0.01-10g的样品，Rf值0.15的情况下，在10-15分钟可快速得到分离。 该法首先由still于1978年详细介绍，1981年获专利保护。,一、层析条件,1、吸附剂硅胶：选用60埃，粒度为40-63um (230-400目)。过大、过小都会使分离度减少。分离度通常用保留时间r对半峰宽w/2的比值表示。,由实验获得硅胶颗粒大小与分离度以及峰宽w(w/v)相关的关系图。,由图可知，在给定的标准条件下
3、，常用硅胶60（70230 mesh, 63-200um）表现出最差的分辨率， 而硅胶60 （4063um）的固定相可得到最好的分辨率。,2、流动相,A 、通常以TLC层析条件为依据，对被分离成分 ，要求Rf值在0.35左右 B、选择在TLC板上对混合成分有良好的分离。要求Rf0.15 Rf值=0.1时，上样量小时也能分离。 C、流速：由实验证实，使用硅胶60 （4063um）作为固定相，流速为2in/min时，可得到最好的分辨率,3、干法装柱：,硅胶高度5-6in15cm左右，装柱法与普通法相同。 溶剂加入后，加压，排除空气，并使硅胶溶剂化。,4、上样、洗脱与收集,采用40-63um硅胶为吸
4、附剂时，柱的大小、硅较用量、加样量、每次收集的体积见表,5、压力泵,一般要求0.4-0.3Kg/cm2 即可。 约2bar/30psi.(每平方英吋磅)， 可通过控制流速 2in/min 来实现。与层析柱上端相接的塞子是一个压力控制伐，可调节压力而调节流速 如图所示。,二、小结,快速柱色谱的条件与步骤： （1）选用对欲分离成分在TLC板上有较好的分离效能的洗脱剂，Rf值0.35；Rf0.15 （2）选择合适的层析柱，内装粒度40-63um（230-400目）的硅胶，高度56inch， （3）加入洗脱剂，在压力下快速将硅胶中空气排除。 （4）上样后，加洗脱剂洗脱，控制(压力)流速2.0in/mi
5、n （约5cm/min）， 以上是快速柱色谱的必要条件 （The crucial for successful separation by this method） （5）一般的样品在15min即可分离出。,三、实验示例,对于光学异构体1和2的分离，选择5的乙酸乙酯/石油醚为洗脱剂，Rf值分别为0.35和0.24，Rf0.09，1g的1与2的混合物，用直径的40mm层析柱，65ml为一个流分，在7分钟内，可迅速分离。洗脱剂总体积为500ml.,四、其他快速层析,1、快速干柱色谱 2、反向快速干柱色谱 （化学键合相填充柱）,第二节 低压液相色谱（LPLC ) 液相层析预制柱法,本法是用直径、高度
6、不同的玻璃柱，二端制成螺纹接口。内装粒度较小填充剂，配成一定机械附件，用含氟塑料细管相连，使操作半自动化。 它不需要HPLC那样的高精密度输液泵( 5bar/75psi )，却具有HPLC的某些优点，层析柱可反复应用，可根据被分离物的不同，制备不同规格层析柱，包括反向层析的填料，分离效果高于一般的柱层析。 上样量高于HPLC，无须特别设备，实用省时，易于普及等优点。Lobar柱可分离g数量级样品，其分辨效果有时可接近HPLC分辨率。,除了自制的色谱柱外，使用最广泛的制备型低压液相色谱系统是Lobar系列产品（MERK公司），其中包括多种规格的预制柱（商品化）。 由于色谱柱是由玻璃制成，所以可看
7、到其中的填料。 色谱柱两端被烧结的玻璃所封闭，色谱柱两端联有聚四氟乙烯环的金属管,分别与输液泵和接受器相联。,各种规格的色谱柱的尺寸及最大上样量见表,Lobar 色谱柱中装有不同的固定相， Lobar 色谱柱可反复使用， Lobar 色谱柱固定相的粒度较大，因此在低压下，流动相可保持较高流速,第三节 中压液相色谱（MPLC）,Labar预制柱的应用，标志着制备型液相色谱方法学的一大进步。然而，用这种色谱柱难以分离5g以上的样品。 为了能承载更多得样品，人们求助于中压液相色谱（MPLC）。MPLC采用更长、内径更大的色谱柱（更易添装）。常使用比低压更高的压力来维持适当流速。5-20bar/25-
8、300psi.，比LPLC具有更高的分辨率及更短的分离时间等优点。,一、色谱柱（预制柱）,皆由自己制备（填装） 1、固定相粒度一般25-200um，最常用的有：15-25um、 25-40um 、40-63um 2、色谱柱的填装时，可以用湿法或干法装柱。,二、商品化仪器,例如：Buchi B680 A系统 可分离100mg-100g样品。 最大压力可达40bar时，流速可在 3160ml/min调节。 UV检测器自动检测系统和自动收集系统。,手工装柱： 干法或湿法装柱。 与湿法凌柱相比，干法装柱可使固定相填充密度提高20。 装填时先将固定相加入连于柱顶的容器内，当固定相装完后，应使容器内多出的固定相体积足以装填10体积的色谱柱，然后将该装置与氮气钢瓶相连。打开色谱柱出口，施加10 bar的氮气压力，直至填料的高度维持恒定。 关闭氮气阀门，先使柱内的压力降至与柱外相同，再对色谱技进行调节。虽然该类色谱柱的最大承受压力只有40 bar，但使用颗粒度为15um 的固定相可以获得同HPLC柱类似的分离效果。,第四节 制备型高效液相 P-HPLC,高压输液泵20bar/300psi HPLC-MS联用仪 高灵敏度检测器 分离速度高，效能大 适用于微量成分的分离鉴定 利用化学键合相填充剂-分离度大大增加 手性柱的应用-手性化合物的分离,
