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1、实验一：细胞的形态观察及其大小测量一、实验目的：1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构；2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。二、实验材料和仪器：小白鼠肝细胞切片；鸡血红细胞；蚕豆叶片横切片；普通光学显微镜；目镜测微尺；镜台测微尺；载玻片；盖玻片。三、实验步骤：(一)细胞形态观察l、动物细胞的观察（1）人肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。（2）鸡血细胞涂片的观察：观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。2、植物细胞的观察（1）取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。（二）细胞的大小和测量1、卸下目镜的
2、上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。2、将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。3、小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线。4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等于多少m：镜台测微尺的格数目镜测微尺每格的微米数= 10 目镜测微尺的格数四、实验结果：1、目镜校正：40倍显微镜目镜测微尺每格的微米数=17/70=0.242、细胞大小的测量： 测量次数 细胞种类一/um二
3、/um三/um平均/um人肝细胞（1040）19.4421.3618.0018.9616.3219.6817.9220.00血红细胞（1040）7.207.687.687.52血白细胞（1040）9.129.609.849.52血小板（1010）1.441.441.441.44栅栏组织（1040）9.1279.2010.0881.1210.5680.649.9280.32五、作业与思考：1、血细胞按含量高低，主要含有：红细胞，白细胞，血小板。白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。红细胞：主要的功能是运送氧。 白细胞：主要扮演了免疫的角色，当病菌侵入人体时，白细胞能穿过毛细血管壁，集中到病菌入侵部
4、位，将病菌包围，吞噬。血小板：止血过程中起着重要作用。细胞形态见下图。2、植物细胞一般比动物细胞大一些。形态图见下。3、在不同放大倍数下，测定的细胞大小基本一致，但有一些偏差。放大倍数越大，在视野中同等实际距离下的两点视野距离更大，而更容易测量准确。实验二：PAS（Periodic Acid Schiff）反应显示糖原和其它多糖物质一、实验目的1、熟悉PAS法原理及操作步骤；2、观察PAS反应的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。二、实验原理多糖是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。另一些多糖在生物体内
5、作为能量贮存，如淀粉（植物）和糖元（动物），在需要时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。三、实验用品：过碘酸酒精溶液、Schiff试剂、亚硫酸水溶液、苏木精溶液、二甲苯、100%乙醇+二甲苯（1：1）。梯度乙醇溶液：100，95，90，80，70，50各两份，一份用于脱腊复水，一份用于脱水。载玻片 、盖玻片、染色缸、显微镜 、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片、土豆；小鼠肝细胞石蜡切片。四、实验步骤:（一）土豆切片的观察制作土豆徒手切片过碘酸处理1530min70%乙醇1min schiff 试剂15min 亚硫酸水漂洗23次 蒸馏水漂洗 镜检（二）小鼠肝细胞切片的观察取鼠肝石蜡切片 二甲
6、苯脱蜡约 10min 二甲苯+100%乙醇（3 min）梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇（100，95，90，80，70，50）中约 23 min 过碘酸 氧化 1530 min 蒸馏水漂洗 Schiff 试剂 1530 min 亚硫酸水漂洗 23 次 蒸馏水漂洗 苏木精染色 10 min 流水冲洗梯度乙醇脱水（50，70，80，90，95，100），在各乙醇浓度中约 23 min 100%乙醇+二甲苯 23 min二甲苯适度透明 指甲油封片 镜检五、实验结果：鼠肝切片观察土豆切片观察六、作业与思考:1、描述土豆切片和鼠肝切片中糖原分布特点。土豆切片中，多糖多在细胞质液泡中。鼠肝切片中，多糖多在
7、靠近核的区域。2、影响 PAS 反应染色效果的关键步骤是什么？Camey固定液固定；Schiff 染色液染色；对分色的控制。3、如何制作徒手切片？应注意什么才能得到薄而均匀的切片？应注意需要连续快速地切下多片薄片，并从中选出较好的切片。实验三：叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的：1、通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/m
8、in的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光，这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光）。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光）。三、实验材料和仪器：普通离心机,粗天平,荧光显微镜，剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管, 10ml刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片，新鲜菠菜，0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridin
9、e orange)、四、实验步骤：1、叶绿体的分离（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵；（2）加10ml的0.35molL-1 NaCl溶液研磨匀浆；（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中；（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀；（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。2、叶绿体的观察（1）滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。（2）滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无
10、荧光盖片；在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。（3）滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。3、完整细胞中的叶绿体观察（1）用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。（2）用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。（3）将以上两种制片进行一下三种方式的观察：a、通光镜下观察。b、光显微镜下观察。c、加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后，在荧光显微镜下观察。五、实验结果: 叶绿体次生荧光叶绿体自发
11、荧光表皮细胞（普镜）木质素表皮细胞（荧光）表皮细胞（光镜）木质素（荧光）六、作业与思考：1、描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？自发荧光：有些生物体内的物质受激发光照射后，直接发出的荧光称为自发荧光，如叶绿素的火红色荧光。间接荧光：有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，则称为间接荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。2、叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？通过研磨绿色植物叶片使叶肉细胞破损，叶绿体被释放到提取液中，再通过等渗介质中差速离心去除杂质， 再次离心，则可分离出叶绿体沉淀。应注意须在低温下迅速提取，且须注意等渗液溶度，离心速度和时间
12、的把握，避免叶绿体破裂。实验四：吖啶橙(acridine orange)染色观察口腔上皮荧光一、实验目的1、熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。2、观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。二、实验原理吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。 三、实验用品荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；口腔黏膜上皮细胞临时制片；0.1mol/L pH7、0 PBS液。0.1吖啶橙原液、95乙醇 四、实验步骤1、用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上； 2、95乙醇溶液固定5min； 3、滴
13、加0.01吖啶橙染液染色5min； 4、用PBS缓冲液缓慢冲洗； 5、加盖玻片镜检。 五、实验结果口腔上皮细胞（荧光）实验五：植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握植物细胞骨架的制备方法，并用光镜观察洋葱内皮细胞的骨架网络结构。二、实验原理细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。本实验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。三、
14、实验用品1、器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml烧杯； 2、实验材料：洋葱鳞茎；3、试剂： pH6.8的磷酸缓冲液、M-缓冲液、1%TritonX-100、3%戊二醛、0.2%考马斯亮蓝R250 染液、50，70，95乙醇、）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶。四、实验步骤1、 取材：撕取洋葱鳞茎内表皮0.51cm2，浸入装有磷酸缓冲液（PH6.8）的小烧杯中，处理510分钟。2、 去垢处理：弃去PBS缓冲液，用吸水纸吸净剩余的PBS，加适量1%Triton X-100，使液体充分浸泡材料，并立即放入37恒温箱或水浴锅中处理30分钟。3、 冲洗：吸去1%Triton X-100，立即加入M缓冲液轻轻冲洗3次，每次35分钟。4、 固定：用吸管将M缓冲液吸尽，加入3%戊二醛，固定1020分钟。5、 冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗3次，每次35分钟。6、 染色：吸去PBS缓冲液，加入适量0.2%考马斯亮蓝R250染料，染色1020分钟。7、 制片：吸去染料，用水冲洗（注意不要将材料丢失）。将洋葱表皮伸展铺平于载玻片上，加盖盖玻片。8、 镜检五、实验结果
