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1、白斑综合症病毒的形态和分子生物学,1992年台湾省北部、1993年日本爆发了对虾病毒病。 以为不同病毒所致，给出专门的名字： 皮下及造血组织坏死杆状病毒(hypodermal and haematopoietic necross baculovirus) 第斑节对虾无包含体杆状病毒(third Penaeus monodon non-occluded baculovirus, PmNOB) 日本对虾杆状核型病毒(rod-shaped nuclear virus of Marsupenaeus japonius, PV-P) 对虾杆状DNA病毒(Penaeid rod-shaped DNA vi
2、rus) 系统性外胚层和中胚层杆状病毒或白点杆状病毒等。 后来发现，全为一种病毒，正式统称为白斑综合症病毒（white spot syndrome virus, WSSV）。我国80%和世界大部分地区对虾死亡的罪魁祸首皆为WSSV。,WSSV的形态学,WSSV属线头病毒科Nimaviridae，完整包膜的病毒体（粒子）长210-380 nm，最宽处70-167 nm。用负染电镜观察，WSSV的病毒体末端具尾状附器(tail-like appendage)。膜厚6-7 nm，为脂质三层膜结构，由不透明电子层分隔成两层透明层。核衣壳位于膜内，为弹簧体型结构，由直径10 nm的球形蛋白亚基构成。这些
3、蛋白亚基沿长轴垂直排列成，每22 nm就有4-15层，使核壳体呈斜纹格形。核壳体从膜里出来后变长，表明它是紧紧压缩在病毒体内。各核衣壳规格各异，长度变化在180-420 nm之间，宽在54-85 nm之间，具有厚6 nm的外壁。,无包涵体的杆状病毒，横切片为圆形。核衣壳一端钝圆，另一端为平头，表面有分段的与与病毒粒子的长轴垂直的15节花纹结构，为指环域堆(ring-structure) 积形成，每个指环结构为由一排直径为10 的亚单位。,第一个被测得的基因组遗传密码的海洋生物病毒、目前已测得的最大的动物病毒之一。,基因组及其分类,环形双链DNA分子，A+T含量占59%，分布均匀。不同隔离群的基
4、因组大小各异，如中国大陆的WSSV为305kbp，台湾省的307kbp，泰国的293 kbp。,WSSV的结构蛋白,有40多种蛋白质，在转录调节病毒增殖和/或DNA复制调节过程中，还有结构蛋白。WSSV病毒体内至少有38种结构蛋白，其中膜上有21种，核衣壳中有10种，间层膜和核衣壳之间有5种。 在膜蛋白VP31、VP110和VP281、间层蛋白VP36A和核衣壳蛋白VP664上有细胞附着基序，对病毒进入细胞有重要作用。其它蛋白（如VP28、VP39B、VP41A、VP51 A、VP51B、VP68、VP124、VP150、VP187、VP281和VP292）和胶原状蛋白位于膜内；而蛋白VP35
5、、VP466、VP15和VP76位于核衣壳上，具有不同的功能。 抗体分析表明，VP28和VP24可能与病毒的穿透作用有关。最近发现，对虾血细胞中的25-Kda 膜蛋白能结合到重组VP28，即WSSV病毒体上。这种蛋白质与小分子GTP-结合蛋白Rab7高度同源。以Rab7抗体进行的中和试验表明，它能抑制WSSV病毒体与细胞结合，减少WSSV感染后的死亡。,用RNA干扰法研究,与VP19相对应的长双链RNA能诱导凡纳滨对虾特殊的抗病毒反应，抑制WSSV感染，大幅度降低死亡率。 而相应的VP28、VP281、WSSV蛋白激酶（PK）及不相关的绿色荧光蛋白的长双链RNA能提高中国明对虾的成活率，用VP
6、28和PK双链 RNA处理的对虾成活率最高。连续3次注射短小的VP28干扰RNA，完全抑制了WSSV对日本对虾的感染。,WSSV基因组含531-684个阅读框，具ATG启动密码子，其中181-184阅读框编码含51-6077个氨基酸组成的功能蛋白，相当于基因组遗传信息的92%。约21%-29%的阅读框编码WSSV蛋白，即与其他已知蛋白相同。这些蛋白包括核酸代谢和DNA复制酶，如DNA聚合酶、非特异性核酸酶、核苷酸还原酶的大小亚基、胸苷激酶、胸苷酸激酶、嵌合的胸苷-胸苷酸激酶、胸苷酸合成酶、dUTP酶和两种激酶。推测还有其他功能蛋白，如胶原状蛋白、鞭毛蛋白、几丁质酶、蛹壳状蛋白、细胞表面絮状蛋白
7、、kunitz状蛋白酶抑制因子1类细胞因子受体、sno状肽和嵌合抗凋亡蛋白。有3个阅读框（泰国隔离群的151、366和418）可编码WSSV潜伏期的蛋白。,WSSV还有3个能立即转录的即时早期基因（台湾隔离群的26、242和418阅读框）。这些基因独立转录，与寄主细胞从头合成的病毒蛋白无关，在体外直接表达。这些即时早期基因在感染期间决定寄主范围，调节反式作用因子。 编码DNA复制和核苷酸代谢所需的蛋白在病毒复制初期即开始了转录合成。初期转录的WSSV基因一般具有TATA框，转录起始位点上游具有20-30核苷酸。结构蛋白是在感染后期合成的，一般有简并TIS基序（A/TNAC/G），该序列位于富含
8、A/T区下游25个碱基的位置，与节肢动物的TIS基序相似。WSSV有一个内核糖体进入位点（IRES）元件，它能使以双顺反子形式构建的谷胱甘肽S转移酶（GST）和绿色荧光蛋白（GFP）在体外同时有效地表达。,泰国、中国大陆和台湾WSSV隔离群的核苷酸序列有99.3%相同。WSSV基因组的不同区域表现出重要的序列变异。我国WSSV基因组有9.63kbp的不稳定区，依寄主的不同发生了不同程度的缺失，使致毒力发生了变化。还有人认为，不同WSSV隔离群的毒力和竞争性适应的差异取决于基因组的大小：基因组最大的WSSV（312 kbp）致毒力最低（半致死时间=12d），竞争性适应程度最小。这与生长中观察到的
9、发病期对虾的死亡率不同有关。,WSSV品系的遗传性、抗原和毒力,WSSV的形态发生,(1) 有感染性的WSSV, (2) 有感染性的WSSV病毒体用具有细胞附着基元的膜蛋白附着到易感染细胞上，(3) WSSV进入细胞，(4) WSSV的膜与内体融合，裸露的核壳体用类似于杆状病毒的方法转移到细胞核内，(5) 裸露的WSSV核壳依附到核膜上，WSSV的基因组释放进细胞核中，(6) WSSV的基因组开始复制，线粒体开始退化，(7) 在细胞核内出现早期病毒发生基质。它由稀疏的颗粒物质组成。细胞内的染色质积聚在核膜附近。粗面内质网膨大而活跃。(8) 边缘的染色质变为浓密的环状区（阴影部分）。病毒发生时基
10、质变淡，开始形成囊泡，囊泡会变成病毒膜。这些囊泡可能由环状区的膜物质构成。病毒的核小体在病毒发生基质中呈丝状结构。(9) 在细胞核（电子密度高的内含物）内组装成新的WSSV。空壳膜内充满核壳。细胞质内的细胞器解体，细胞和细胞膜破裂。(10) 形成完整的WSSV病毒体即将从破裂的细胞中释放出来，开始感染新的细胞（新的循环）。,1期：细胞感染初期。被感染细胞的细胞核略膨大。病毒颗粒形成之前先出现病毒核小体。病毒颗粒由纤维状的病毒蛋白形成。细胞质中内质网膨大，具有大量游离核糖体。 2期：细胞核内的纤维物质诱导形成环形膜，膜上很快就充满了病毒核物质，开始了病毒的组装。此期在病毒发生基质和高电子密度的边
11、缘染色质之间的半透明区内出现Cowdry-A型内含物。细胞核膨胀呈圆形。,3期：在细胞核内出现了核壳。核壳电子密度低，由一端向另一端生长，初为开口。因具有大量病毒颗粒，中部核内含物比第2期的细胞小，电子密度高。边缘染色质消失时，核膜破裂，边缘透明区与发亮的细胞质融合。大多数细胞器异常，分离，形成膜结构。 4期：细胞核内的核壳形成致密的12-14圈球蛋白单位。每个核壳的一端圆、一端方，由膜完全包围起来。,5期：病毒形成的后期。病毒颗粒呈卵形，可见到由膜衍生成的长尾状突起。尾内物质脱离核壳，之后因病毒内有DNA-VP15复合物而变短，增厚，电子密度增加。 6期：形态发生的最后阶段。成熟的病毒体椭圆
12、形，光滑的膜包围高电子密度的核衣壳，在最后包被的一端有尾状突出。有时组装完的核壳与膜完全脱离，而褶皱。在这最后阶段，感染的细胞严重损伤，随着细胞解体，组织中出现一些空泡。,原位杂交表明，WSSV 主要在斑节对虾仔虾胃角质层下的皮下细胞和鳃皮下及肝胰脏细胞中复制；也有人认为是在中肠干上皮细胞中复制。在24-26下，体长2-3cm的日本对虾人工感染WSSV 后3d，各组织器官内未观察到明显的病毒感染阳性细胞；第4d首先在鳃丝腔内的少量血细胞中观察到病毒感染；第5d除血细胞外，同时在血窦鳃上皮组织、皮下组织内观察到；第6d在心脏、胃上皮组织内观察到；第7d在淋巴器官、中肠内观察到；第8d和第9d所有
13、样品上述组织器官中均为WSSV 病毒阳性。 病毒从最初的复制部位扩展到其他靶器官有二种途径：螯虾等是通过血细胞到达远处的靶器官；淡水虾和对虾等是通过游离血淋巴循环到达靶器官。PCR检测表明，至少有18种养殖或野生对虾、8种真虾、7种龙虾、7种螯虾、38种蟹、6种非甲壳动物、轮虫和毛颚动物及一些水生昆虫幼虫呈WSSV阳性，多数为WSSV的机械携带者。,阻断病毒感染的新途径,目前应用研究的进展： 1. 抗病转基因育种：通过转基因的方法将某种基因导入虾体，培育优质抗病对虾新品种。 1）导入核酶基因，切断核酸合成 技术路线： 2）导入包膜蛋白的反意RNA，阻 断翻译包膜蛋白 3）导入新包膜蛋白基因，翻
14、译错 误的包膜蛋白 例子：利用基因枪转移以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因作为报告基 因的重组抗WSSV核酶基因的质粒 pCDNA-RZI，成功得到转GFP基因的中国 对虾。,阻断病毒感染的新途径,2. 基因工程药物： 原理：阻断病毒与被感染细胞表面受体的结合，降低致病力；诱导产生“类免疫应答”(quasi-immune response)。 例子：1）用大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组 WSSV囊膜蛋白rVp28口服免疫斑节对虾，7天浸 溶攻毒免疫保护率达77%； 2）用大肠杆菌表达的重组WSSV囊膜蛋白rVp28和核 衣
15、壳蛋白rVp26肌肉注射免疫日本对虾， 30天注射 攻毒免疫保护率达分别为95%和60%； 3) 以家蚕核多角体病毒（Bombyx mori L. nuclear polyhedrosis virus, BmNPV）表达系统表 达的WSSV囊膜蛋白rVp28和rVp19口服免疫克氏原 螯虾，30天口服攻毒免疫保护率高达97%。,昆虫杆状病毒载体系统,1. 昆虫杆状病毒：它个体最大，能容许基因较大 区域的缺失或替换，能容纳大片段外源DNA的 插入，增加外源基因表达的有效途径。去除某 些基因，如半光氨酸蛋白酶、组织蛋白酶、几 丁质酶基因能增进重组蛋白的稳定性。 2. 杆状病毒表达载体系统：是一种辅
16、助性依赖 （仅指粒载体不能表达外源基因）的真核DNA 表达载体；以昆虫杆状病毒，主要是家蚕核多 角体病毒为外源基因载体，以昆虫或其细胞为 受体的表达系统。,家蚕（Bombyx mori L. nuclear polyhedrosis virus, BmNPV）表达系统生产预防WSSV蛋白,特点：家蚕具开放式血管系统，纤薄而强韧的表皮层包围着充满血淋巴及各种器官的空间，是个微妙的高效“发酵罐”；产物能糖基化、磷酸化、酰胺化等各种修饰作用。 程序：1)目的基因克隆进杆状病毒载体质粒内；2）与野生型病毒基因组一起共转染蚕体细胞；3）检测出表达的抗原性蛋白；4）用于实验对虾。,应用前景：变“夕阳产业”为“朝阳产业”,用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)生产鱼类弹状病毒属(Rhabdovirus)出血性白血病病毒(viral hemorrhage septicemia virus, VHSV)的一种表面糖蛋白，诱导产生抗体。 用重组的家蚕核多角体病毒在家蚕幼虫体内表达了草鱼的生长因子。将重组病毒感染的家蚕幼虫制成饵料喂鱼、虾。,
