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1、药物的体外抗菌技术,项目八,学习目标,1.熟悉药物体外抗菌试验的用途及意义 2.掌握体外抗菌试验的基本方法,药物的体外抗菌试验：又称药敏试验，是为了检查药物的抗菌能力，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。,药敏试验,抑菌试验：,杀菌试验：,只能抑制微生物生 长，不能杀死微生物。,可以杀死微生物,药物的体外抗菌试验,用途： 筛选抗菌药物、测定血药浓度 测定抗菌谱、耐药谱、效价 提取过程中的生物追踪,优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。 缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。,药物的体外抗菌试验,抗菌试验的影响因素,1、试验菌： 用专门的供应机构提供的标准菌株
2、。 北京卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中心。 试验菌应合理保藏，用前加以纯化及生物学特征鉴定。,所用的试验菌株应处于对数生长期，因此期的微生物对外界因素变化最敏感。 试验结果的灵敏度在一定程度上与试验菌的接种量成反比关系，故应选用适宜的接种量。,抗菌试验的影响因素,2、培养基 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用沙氏培养基。 培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果因素的掺入。 经无菌检查合格。,抗菌试验的影响因素,3、抗菌药物 药物的浓度、pH及含有的其他成分均可影响试验结果，特别是中草药制
3、剂往往含有色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结果，应加注意。,抗菌试验的影响因素,4、对照试验： 为精确判断实验结果，试验时应设各种对照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂和稀释液对照等。,在实际工作中，往往可见到体外实验有作用的药物，进入机体后由于各种原因而失效，有的药物毒性很大也不能用于临床。,常用的体外抑菌试验,体外抑菌试验,琼脂扩 散法,平板挖沟法,纸片扩散法,连续稀 释法,液体培养基稀释法,固体培养基稀释法,琼 脂 扩 散 法,原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分，溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度
4、范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。,纸片扩散法： 制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 最常用的方法，适用于多种药物或一种药物的不同浓度对同一试验菌的抑菌试验，多用于新药的初筛及临床的药敏试验。,(二)培养基和抗菌药物纸片,1抗菌药物纸片 选择直径为6.35mm，吸水量为20l的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于2-8，且不超过1周。 2培养基 水
5、解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4保存。,试验程序,1.用接种环分别在琼脂平板上挑取形态相似 的大肠杆菌菌落45个，接种于35mL肉汤管中 2.35温箱培养28h，与标准比浊管比较，若菌液浓度太浓时，可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同 3.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干,（三）试验步骤,4. 用镊子蘸取95%乙醇并通过火焰，待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作，共三次即可达到灭菌的效果。待冷却后，用此无菌镊子夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片
6、间距不小于24 mm，纸片距平板边缘不小于15mm。 5. 35温箱培养1824h观察结果。,纸片法的原理,（四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据NCCLS标准，作出“敏感”、“耐药”和“中介”的判断。,几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度,（五）药物敏感试验结果解释,“敏感”（susceptible，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制； “耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。 “中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中
7、的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。,挖沟法： 1、在琼脂平板上挖沟，沟两边垂直划线接种各种试验菌，沟内加入药液。 2、培养后，根据沟两边所生长的试验菌离沟的距离来判断药物对试验菌的抗菌作用强弱。 适用于在一个平板上试验一种药物对几种不同试验菌的抗菌作用。,琼脂扩散法具有方法简便，技术要求不高，易掌握操作的特点。但精确度不高，一般能用于定性或初步判断其作用的强弱。 液体稀释法是一种测定药物的抗菌作用定量方法，较琼脂扩散法精确，因而运用较普遍 。,凡能抑制试验菌生长的最高药物稀释度为该药的最低抑菌浓度 （Minimal inhibitory concentration，MIC
8、）。 以培养后无细菌生长的最高药物稀释度为最小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC）。,液体连续稀释法,1、在一系列的试管中用液体培养基将试验药物作连续对倍稀释，使药物的浓度沿试管顺序成倍递减。 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 1624 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照观察。 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药物有杀菌作用。,MIC及MBC的测定,不含药的平板,MBC,在测定中草药煎剂时，由于有些煎剂颜色较深，肉眼不易分辨是否有效；需再于每管中取数环移种于
9、适当的培养基上，经培养后观察有无细菌生长而决定之。,体外杀菌试验技术,杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性 1.最低杀菌浓度测定（MBC） 2.活菌计数法 每毫升的活菌=菌落数*稀释倍数/稀释液用量 致死率=（总菌数-活菌数）/总菌数*100%,体外杀菌试验技术,3.化学消毒剂的效力测定 标准：苯酚 酚系数=消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度 酚系数越大，化学消毒剂的效力越高,联合抗菌试验技术,主要应用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。 协同：两种抗菌药联合应用时抗菌作用加强 拮抗：抗菌作用减弱 无关：相互没有影响,纸条实验法,最简便、最常用的方法 在涂布接种细菌的平板上，垂直放置两条浸有不同药液的滤纸条，在适宜的条件下培养后，观察两药形成的抑菌区的图形，来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作用。,
