第十二章遗传重组

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1、第十二章 遗传重组 Chapter 12 Genetic Recombination,重点与难点,重点：同源重组、位点特异性重组和转座的概念、特征与类型 难点：同源重组、位点特异性重组转座的分子机制,基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡，这样才能使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。,突变和重组是提供进化起始物质的两个过程。 突变引起的遗传改变能引起蛋白质中氨基酸序列的变化，该变化引起表型的改变，通过自然选择发生作用。 重组提供一个基因组结构的变化，也会引起表型的变化，也通过自然选择发挥作用。,一、遗传重组的

2、概念和类型 二、同源重组 三、位点特异性重组 四、转座 五、异常重组,主要内容,一、遗传重组的概念和类型,1、遗传重组的概念 细胞之间或DNA分子之间核苷酸片段的交换或者转移。 广义指：任何造成基因型变化的基因交流过程，包括减数分裂中染色体的随机组合、连锁互换、雌雄配子结合形成的新的基因型、 细菌杂交、转导、转化、转座、整合等； 狭义指：仅涉及到DNA分子断裂愈合的基因交流过程，包括连锁互换、细菌杂交、转导、转化、转座、整合等。,2、遗传重组的类型 1）同源重组（homologous recombination） 同源染色体间或同源序列之间某区段的交换。包括真核生生物同源区段的交换，细菌同源区

3、段的交换 。 2）位点特异性重组（site-specific recombination） 供体DNA仅整合在受体DNA的某一位点的重组。如噬菌体仅能重组在E.coli的生物素操纵子与半乳糖操纵子之间 3）转座（transposon） 一些DNA片段或噬菌体DNA能在大肠杆菌的质粒间、DNA间来回转移的重组。 4）异常重组（illegitimate recombination） 指一些非法交换、不对等交换现象.如末端连接和链的滑动。,二、同源重组,同源重组（homologous recombination）: （1）发生在同源DNA序列之间,一、特征,（2）负责DNA配对和重组的蛋白质因子无碱

4、基序列 特异性,（3）产生两种对应的重组体,细线期,偶线期,粗线期,双线期,终变期, e.g. Euk.减数分裂时 的染色单体之间 的交换 细菌的转化， 转 导，接合，噬菌体 重组,二、进行同源重组的基本条件,（1）发生同源性重组的两个区域的核苷酸序列必须是相同或非常相似的。 同源性重组常常只发生在两个DNA分子中的相同部位。,（2）双链DNA分子之间互补碱基进行配对 两个DNA分子的链之间互补的碱基配对确保重组只发生在同样的基因座之间。 在该部位两个双链DNA分子通过链之间互补的碱基配对被维系在一起称为联会。,（3）重组酶 参与重组反应的酶保证重组的顺利进行。 重组过程中，每个分子的链首先断

5、裂，然后进行修复和连接，两个DNA分子之间发生交换;重组完成后，重组分子的解离和释放等过程均是在酶催化下进行的。,（4）异源双链区的形成 同源性重组时，在两个DNA分子之间互补碱基配对的区域称为异源双链区（heteroduplex region）。,三、同源重组的分子机制,1、 断裂复合及Holliday中间体的形成, Holliday结构 同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链， 在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为, 同源重组都涉及到DNA分子内的断裂复合,1964年Holliday提出，又叫Holliday模型 第一步 联会 同源的非姊妹染色单体间联会形成联 会复

6、合体 第二步 酶切 内切酶分别在DNA分子上各切开一条单链 第三步 交换重接 第四步 形成交联桥结构 第五步 分支迁移，形成Holliday结构 第六步 分支构型变化 第七步 分支绕交联桥旋转1800 第八步 Holliday中间体拆分,2、遗传重组的酶学机制 在遗传重组过程中，尤其在同源重组中需要recA蛋白和recBC蛋白. recA蛋白又叫重组酶、重组蛋白、X蛋白、依赖于ATP的酶。 recA蛋白由E.coli的recA基因编码，分子量约38 000 Da，由353个氨基酸组成，其主要作用是促进同源DNA联会，促进DNA分子间单链交换形成交联桥和Chi结构，此 酶有多种特性。,1）单链D

7、NA结合活性，保护单链并促进recA与单链结合 2）依赖于单链DNA的ATP酶活性 3）DNA解旋活性，解开双螺旋 4）NTP酶活性，能水解ATP、GTP、UTP、CTP促进联会发生 5）促进互补单链复性 6）蛋白酶活性和外切酶活性,RecA引发链侵入模型,RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.,RecA启动的单链入侵,RecA引起的链交换和Holliday结构的生成,recBC

8、蛋白：recB和recC基因的产物，分子量约为300 300 Da。在同源重组中具有核酸酶的作用、切断Holliday中中间体完成重组。此酶又叫外切核酸酶。在同源重组过程中例如在细菌的接合、转化、转导过程中都有此酶起作用。, RecBCD的识别和切割位点,a、 RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚）,b、 外切、解链、移动 （ATP）,c、 兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性）,d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处切 断单链（单链内切酶）, chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1000 个、E

9、uk.,Ruv酶：即ruvA、ruvB和ruvC编码的一组酶。,a、 RuvA 识别 Holliday 结构的连接点,b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s）,c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体,3、分枝迁移和Holliday结构的拆分, 分枝迁移（branch migaration） 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散,Holliday的异构化,产生重组体的拆分,Holliday结构一经生成即可 不断地处于异构化异源双链 heteroduplex DNA,重组结果取决于拆分时 配对链上的切口位置,“

10、亲本链”,“重组体”,1,2,三、位点专一性重组,一、位点特异性重组（ site-specific recombination）,1、概念：发生在专一序列而序列极少相同的DNA分子间 的重组,噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组,2、特征：, 在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的DNA重排, 具有整合作用的两个基本特征,a、 典型的保守性重组,b、 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上,二、phage的整合与切除,1、实现机制：,均是通过-细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组,2、特定位点-附着位点（attachment site att）, E

11、.coli attB 含BOB三序列 25bp, phage attP 含 POP三序列 240bp, 核心序列 “O”完全一致 （同源部分） -位点特异性重组发生的地方, B,B,P,P-臂,3、整合过程, 整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB）, 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR, 整合过程需要整合酶 （integrase Int）（编码） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用,4、噬菌体整合的分子机制 1）联会 噬菌体进入E.coli中自动成为环状结构，以此环状结构参自身的attP区与E.c

12、oli的attB区互补联会 2) 酶的结合 整合酶：(Int)噬菌体的int基因编码一种DNA结合蛋白，此酶对POP有强的亲和力，对BOB也有合力，具有拓扑异构酶的活性，即可以DNA切断再连起来。 整合寄主因子：(I H F)由E.coli编码的一种结合蛋白，对attP位点有强的亲和力。,Int .IHF二者结合在供体和受体DNA的互补处 3）酶切 整合酶在一条链的+4位，另一条链的-2位切开attB和attP，形成参差不齐的5单链末端，5-OH 3-P 4)重接 切开后瞬间DNA分子发生旋转，又在整合酶作用下使断口处连接起来。重新连接时断头与断头之间发生错接导致噬菌体整合到E.coli的基因

13、组中, Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分, 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交,-DNA从E.coli的切离：,-DNA对E.coli的整合：,BOPPOB （原噬菌体）,BOB （细菌）,+,POP （噬菌体）,Int,IHF,BOPPOB （原噬菌体）,BOB （细菌）,+,POP （噬菌体）,Int，Xis,IHF,溶源性细菌 (lysogen),溶菌周期 （lysis）,原噬菌体,四、转座重组,一、转座成分概述,1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上

14、不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）,转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）,2、发现和发展, 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变,玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理,跳跃基因（jumping gene）, 1947 冷泉港实验室（美） Barbara McClintock,a) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性,b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制,Hotspots (热点) Regional preference (

15、在3kb区域内的随机插入),d) 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）,e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复,f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应,3、转座重组的特点,c) 转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）,二、原核生物转座子种类,简单转座子（插入序列，insertion sequence，IS ） 复合转座子,共同特征： a）两端有2040bp的反向重复序列（IR） b）具有编码转座酶（transposase）的基因,1、插入序列,最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名： IS编号（鉴定类型） 长度 7002000bp,两端IR为转座酶的识别位点,特点： 插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（39bp）,Tn / TnA family,l 具有IR、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因,l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR),2、复合转座子（Composite transposon,Tn）,大小,复合转座子的两端常常含有IS或IS的一部分，表明复合转座子可能是在细