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1、分子生物学技术在病理 生理学中的应用 中南大学湘雅医学院病理生理学系 谭斯品,一、21世纪是生命科学的世纪,1953年：Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，获 1962年诺贝尔奖。 60年代中期：确定遗传信息传递的中心法则： DNARNA蛋白质 1967年：破译全部遗传密码（三联密码），获1968 年诺贝尔奖。 1968年：发现限制性核酸内切酶获1978年诺贝尔奖。 1972年：产生第一个重组DNA分子。 1982年：建立第一个转基因动物模型。 1990年：首例基因治疗。 1990年：启动人类基因组计划。 2003年: 基本完成人类所有基因的全序列测定,后基因组时代开启。,二、分子生
2、物学发展简史,Function,Function,Transport / Localization Oligomerization PTM (Post-Translational Modification),mRNA,Splicing,基因与基因组学的分子生物学技术,蛋白与蛋白质组学研究,生物信息学,动物基因工程,基因工程与基因治疗,表观遗传学,三、分子生物学技术与休克研究- 基于基因表达水平的研究,一)、休克的细胞、分子机制要览,(一)mRNA水平 1、Northern blot 2、核酸酶保护分析法 3、逆转录PCR（RT-PCR） 4、DNA芯片或微阵列,二)、休克时基因表达的研究,1、
3、Northern blot 将待测RNA样品经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上，利用碱基配对原理将标记的核酸探针与该固相支持物进行固-液相杂交，以检测样品中RNA（主要是mRNA）水平的方法。包括样品RNA制备、琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针制备、杂交、显影等步骤。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。,Northern blot,2、核酸酶保护分析法（RNase protection assay) 属液相杂交。即待测RNA分子与核酸探针都 存在于杂交液中，根据碱基配对原理形成杂 交分子，利用RNA酶A（RNase A)能降解单链 RNA而双链RNA则受到保护的特点，
4、检测样品 中特定RNA分子的存在及其水平。包括RNA样 品制备、RNA探针制备与标记、液相杂交、 RNA酶降解单链RNA、电泳分离双链RNA分子、 显影等步骤。,3、逆转录PCR（RT-PCR） 以样品中的mRNA分子为模板逆转录生成 cDNA,再采用待测基因特异性引物进行 PCR反应以扩增该cDNA分子，然后通过检 测cDNA分子的量来反映样品中该基因mRNA 的表达水平。,* PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction）, 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了1
5、993年的诺贝尔化学奖。,PCR的定义:,巢式PCR 原位PCR 多重PCR 定量PCR 不对称PCR 差异显示PCR 共享引物PCR 重组PCR 锚定PCR (十一)RT-PCR 彩色PCR (十二)RAPD (十三）eal time RT PCR,PCR的分类:,4、DNA芯片或微阵列 （DNA chip or microarray） 在微小的固相支持物上直接合成或点上成千上 万个基因片段(寡核苷酸或cDNA片段），从待 测组织样品中提取总RNA(或mRNA)，逆转录成 cDNA并标上同位素或荧光物质后，与DNA芯片 杂交。通过检测DNA芯片中各基因点的荧光或 同位素强度，判断出样品中成千
6、上万个基因的 表达水平。 用途:用于基因转录水平的检测、基因组分析和 后基因组研究,Fig.3 The numbers of up-regulated and down-regulated genes in lung tissues of mice during endotoxic shock,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,19,疾病的分子机制：病原,病理和预后， 疾病的易感性， 遗传与环境的影响。,分子诊断：疾病的预测,药物耐受性， 疾病的分型。,More than thirty thousands of cDNA or oligo DNA can be on a microarr
7、ay. Any special subset of genes can be included in a microarray.,What is Microarray (Gene-chip, Biochip),The Arrayer,人类疾病大致分为三类： （一）单基因病 （二）多基因病 （三）获得性基因病,基因病：以基因组学为基础，从疾病 和健康的角度考虑，人类疾 病大多直接或间接地与基因 相关。,RNA Isolation,Cell Lines,Model Systems,Pathology,Laser Capture Microdissection (LCM),Total RNA,The
8、 Full Yeast Genome on a Chip,The DNA chip - is designed to probe a biological sample for gene expressional information,Chip/Microarry,Scatter plot of microarray data,1、电泳迁移率变动分析 2、报告基因测定,三)、休克时基因表达的调控,研究基因表达调控的经典实验: 电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）,EMSA是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，核心功能是验
9、证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白分子。,局限: 对于低亲和力结合很难进行鉴定； 难以比较不同片断之间亲和力大小的差异； 对于蛋白复合体与DNA的结合也无法鉴定。 由于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测（EMSA）很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程。,A. Effect of HSR on LPS-induced DNA binding activity of AP-1.,B.Effect of HSP70 over-expression on LPS-induced DNA binding activity of AP-
10、1.,Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。,Fig 6. Luciferase report gene assay sho
11、wed the effect of wild-type HSF1 on the transcriptional activity of G-CSF promoter induced by LPS.,A,B,Fig 7. Luciferase gene report assay showed effect of inactivated HSF1 on the transcriptional activity of G-CSF promoter induced by LPS.,染色质免疫沉淀技术 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）,CHIP是目前
12、唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。,四、蛋白质组学研究,蛋白质组学概念的产生: 1994年澳大利亚Macquaie 大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质（Proteome）这个概念 。,“PROTEOME”是由蛋白质的”PROTE”和基因组的“OME”字母拼接而成 ，定义为“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质”,蛋白质组学的研究内容包括：,1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。 2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸
13、化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。,3.蛋白质功能确定： 如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。 4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展: 如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预
14、蛋白质-蛋白质相互作用。,一、 Western Blot,1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。,2 操作过程,SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影,二、大鼠心肌缺血预适应延迟相的蛋白 质组学分
15、析,心肌缺血预适应（ischemic preconditioning, IPC）： 是指一次或者多次短暂缺血并恢复血流再灌注，可增加心肌对其后更长时间缺血损伤的耐受性的现象。 两个时相： 早期保护（early phase）：数分钟内出现，持续23h； 延迟保护(second window, late PC)：24小时后重现保护作用，可持续约72h。 保护作用主要表现在缩小心肌梗死范围，减少心律失常的发生，改善心肌收缩和舒张功能等。,缺血预适应概念的提出及其临床价值,1 缺血预适应延迟相可能有多种蛋白质 表达发生改变，但究竟涉及哪些主要 蛋白质，目前仍不清楚。 2 采用蛋白质组学技术识别IPC延
16、迟相 的主要蛋白质分子，有助于延迟相心 肌保护机制的阐明及心肌缺血再灌注 损伤的防治。,（一）、大鼠心肌IPC延迟相模型制备,SD雄性大鼠（250300克），随机分为2组： 、IPC组 反复结扎-松解左冠状动脉前降支（缺血3分钟，再灌10分钟， 反复4次）。 、假手术组 穿线62分钟，不予缺血处理。 两组于24小时后，再次缺血45分钟，再灌3小时。再灌末，取血测CK值，取非灌注区心肌测定梗死面积。,实 验 结 果,大鼠心肌缺血预适应延迟相模型制备,梗死面积比较,肌酸激酶值比较,*,#,n=6,n=6,n=6,n=6,#,sham组双向电泳图,IPC组双向电泳图,两组差异蛋白点的标记,No. Normalized volume P-value m
