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1、农药残留速测技术,胡草,酶抑制法理论知识,此种方法主要是从家蝇或其他动物组织中提取乙酰胆碱酯酶，将乙酰胆碱酯酶与蔬菜样本提取液混合，以碘化乙酰硫代胆碱为底物，二硫双硝基苯甲（ DTNB）为显色剂，经一段时间后比色，根据吸光值，计算乙酰胆碱受抑制的程度。,酶抑制法,如果蔬菜的提取液中不含农药或残留量很低，酶的活性就不被抑制，试验中加入的基质就被水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色或水解产物本身有颜色。,酶抑制法,如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，基质就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。在412nm测定吸光度的变化，计算出抑制率就可判断农药（有机磷和氨基甲酸
2、酯类）的残留情况。（有机磷和氨基甲酸酯类农药占全球农药的57%以上） 。,酶抑制法,酶抑制法,影响速测结果准确度的问题：一是酶的质量，这是最主要的因素。虽然该技术在全国已使用了几年，普及面已很大，但由于对酶的质量没有统一的标准，对市场上流通的酶产品没有质量监管，所以检测结果也是五花八门。目前提高酶的质量主要是提高酶的灵敏度和稳定性。二是检测设备的质量。三是操作过程的规范性。,酶抑制法特点,由于现阶段蔬菜农药残留主要是有机磷和氨基甲酸酯类农药超标，而对人体造成危害的是农药残留总量，农药残毒速测方法正适应了以上两个特点，可以快速检测上述两类农药严重超标的蔬菜水果，防止食用引起急性中毒，同时还具有短
3、时间内检测大量样本、检测成本低、对于检测人员技术水平要求低、易于在基层推广等特点，是现阶段我国控制高毒农药残留的一种有效方法。但是只定性不定量。对一些含辛辣物质的蔬菜如萝卜、韭菜等，以及茭白、蘑菇，此方法不适用。,显色前,显色后,快速检测技术和试剂,快速检测仪器和设备,快速检测仪器和设备,速测仪的种类,速测仪的种类按一次可测定的数量分可分为三类： 八通道以下的，即一次最多可测定七个样品。大部分厂家的仪器都属于这一类； 大于8通道小于80通道的，目前有12通道和36通道的； 80通道以上，即一次可测定80个以上样品。,速测仪的种类,从仪器分光结构上可分为二类： 分光装置使用滤光片； 分光装置使用
4、光电二极管。 建议使用分光装置使用滤光片的仪器。,试 剂,提取试剂： p H = 8 缓冲液,一包加500毫升蒸馏水. (先加少量水溶解后在稀释) 胆碱酯酶：乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶，加入缓冲液25毫升,4以下保存。 显色剂： 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB),一瓶加磷酸缓冲液25毫升,4以下保存。 底物：碘化硫代乙酰胆碱(ATCI) 或碘化硫代丁酰胆碱(B TCI)一瓶加磷酸缓冲液12.5毫升， 4以下保存。,蔬菜农药残毒快速检测流程图,取样（叶菜类2克，非叶菜类4克），切碎,加入20毫升提取试剂，震荡12分钟,于平底小试管中加入50微升酶、3毫升样本提取液、50微升显色剂在3738下培养3
5、0分钟,于待测的5只平底小试管内分别加入50微升底物分别倒入5只比色皿中，放入仪器进行测定,注：对照组的比色皿中用3毫升提取试剂代替样本提取液,结果计算,抑制率（%）= 抑制率：酶被抑制的程度 A c :对照组3min 后与3min 前吸光值之差; A s :样本3min 后与3min 前吸光值之差 抑制率与农药的浓度呈正相关的。,样本检测,阴性,阳性,复测（两次以上）,阴性,阳性,仪器分析,根据市场规定处理,检测结果判断标准,检测结果以抑制率（%）表示 抑制70% 合格； 抑制70% 至少两次以上重复检测 不合格 用GC进一步定性定量分析。 （NY/T448-2001）,检测结果判断标准,抑
6、制率70 %时,至少两次以上重复检测，蔬菜中肯定存在有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，样品为阳性，用其他方法确认。,农药残毒快速检测技术关键点,采样要求 样品制备 试剂的配制与保存 检测过程 解释检测结果的异常现象,采样要求,随机抽取摊位上各部位的蔬菜, 每种样本至少取0.51kg左右, 要求具有代表性。 抽检样本要详细记录。如蔬菜种类、抽检地点、时间、蔬菜来源、批发商等，保证可追溯性。,样品制备,选取包含大、中、小个体具有代表性的蔬菜，擦净表面泥土，用取样器取样或剪成1cm见方碎片，待用。 叶菜、普通油菜：用取样器从叶片部位取样，不少于8片叶子。称取2g测定 花椰菜和青花菜：取花球部分，切成小块
7、，混合均匀。 大白菜、甘蓝、球生菜：选取3至5棵菜，用取样器从蔬菜对称位置从表面穿至1-1.5cm处取样，混合均匀。,样品制备,果菜（番茄、茄子、辣椒）和瓜类（黄瓜、西葫芦）菜：从果实对称部位取果皮，切成见方小块，称取4g测定 豆类菜（包括：菜豆、豇豆、荷兰豆等）：选取多根菜豆，从中截取一段，再切成小段，混匀，称取4g测定,试剂的配制与保存,酶的要求 底物与显色剂,酶的要求,选择对国内常用的有机磷和氨基甲酸酯类农药较敏感以及活性高的胆碱酯酶。 以3min后与3min 前空白吸光值的差值即Ac在0.40.8之间为佳（国标为0.3以上）。 如果空白Ac低线以下,可适当加大酶的加入量，或减少溶解酶的
8、缓冲液。 粉状的酶应储存在冷冻室内,用缓冲液溶解后应储存在05冷藏室内,在一周内用完；溶后暂时不用的酶要保存在冷冻室内,用时解冻,解冻后一周内用光,不要反复解冻,否则会影响酶的活性。,底物与显色剂,加入缓冲液至试剂瓶中，摇匀，储存于冷藏室中。 在使用过程中避免交叉污染，观察试剂颜色是否正常。,检测过程,使用移液枪时，避免溶液吸空或推液不尽导致所取溶液体积不准，造成数据不准确 反应温度、反应时间对酶抑制率的影响 温度对酶的活性和稳定性影响很大，因此实验必须在恒温条件下进行，使空白和样品的反应温度一致，避免实误差。,检测过程,不同酶抑制时间影响酶的抑制率。随着酶抑制时间的延长，抑制率也随之提高。所
9、以实验操作中必须控制酶抑制时间，使空白与样品的反应时间完全一致 番茄等蔬菜含有天然色素，振摇后有絮状物悬浮，需延长静置时间，减少干扰,检测过程,比色皿的使用：注意手不要摸比色皿的光面，要拿毛面，光面对准光路。 比色皿的液体要超过三分之二，且不要溢出，要保持光面外侧的洁净。 比色皿用完后及时洗净，倒置在垫有滤纸的瓷盘内，晾干后收于比色盒。也可用弱酸浸泡，不可超声。,检测结果的异常现象,假阳性的产生 用速测卡检测容易出现假阳性。原因出在酶的活性上。酶需要在低温下保存,速测卡浸过酶的小纸片, 放置一段时间后,酶的活性会降低甚至失去活性。而且酶的反应受环境人为等诸多因素影响, 因此很容易出现假阳性。,
10、检测结果异常现象的解释,当酶的活性会降低或失去活性时,酶在底物中不起作用,底物不能被水解,因此也无法与显色剂结合生成黄色,这种阳性的产生不是由于农药的存在抑制了酶的活性, 而是酶本身就失去了活性造成的。,检测结果异常现象的解释,抑制率出现负值 正常的检测结果应该在110%-10%之间。结果中抑制率偶尔出现负值, 这是指在计算中样本的As比空白值的Ac要大。造成的主要原因是: 操作中的系统误差,从吸光值变化动态曲线可以看出,酶分解底物、分解物再与显色剂结合,这样的动力学过程进行的是非常快的, 如果操作中不够熟练就会产生人为的系统误差 同一种蔬菜,由于不同次重复提取时所取蔬菜样本的部位不同,这种较
11、小的负值误差(-10%以下)是在允许范围之内,检测方法（行标）,（NY/T448-2001） 取样（叶菜类2克，非叶菜类4克），切碎 ，放入提取瓶内，加入20毫升缓冲液，震荡12分钟 ，倒出提取液，静止35分钟；于试管中加入50微升酶、3毫升样本提取液、50微升显色剂在3738下培养30分钟后 再分别加入50微升底物，倒入比色皿中，用仪器测定。抑制70%为合格；抑制70% 不合格至少两次以上重复检测,检测方法（国标）,（GB/T5009 199-2003） 选取有代表性的蔬菜样品，去掉表面泥土，取样品1克，放入提取瓶内，加入5毫升缓冲液，震荡12分钟 ，倒出提取液，静止35分钟，待用。试管中加入2.5毫升样本提取液，加入酶，加入0.1毫升显色剂，摇匀后于37放置15分钟以上。加入0.1毫升底物摇匀。倒入比色皿中，用仪器测定。抑制50%为合格；抑制50% 不合格至少两次以上重复检测,仪器商家方法,取样（叶菜类2克，非叶菜类4克），切1厘米见方碎片 ，放入提取瓶内，加入10毫升缓冲液，震荡12分钟 ，倒出提取液，静止35分钟；于试管中加入100微升酶、2.5毫升样本提取液、100微升显色剂在3738下培养15分钟后 再分别加入100微升底物，倒入比色皿中，用仪器测定。抑制50%为合格；抑制50% 不合格至少两次以上重复检测.,谢谢聆听！,这些菜放心食用吧！,
