《第六章 酶的分离与纯化(20140320)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章 酶的分离与纯化(20140320)（88页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酶学分析,第六章,enzymatic analysis,掌握酶的分离纯化的基本原理和基本方法 掌握酶活力测定的原理和酶活力的计算方法 熟悉同工酶测定的意义 了解测定酶促反应速度的方法,目 的 要 求,细胞结构与酶分布,第 一 节 酶 的 分 离 纯 化,酶的提取、分离纯化技术路线,酶的分离纯化一般包括三个基本步骤,(1)抽提：采样 细胞破碎 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法。 (2) 部分纯化: 初步的纯化，使用各钟柱层析法和电泳法。 (3)结晶或制剂: 目标酶的进一步精制纯化，可用亲和层析或 HPLC,一、酶的分离纯化前的预处理抽提,（一）酶提取的影响因素,1酶的储存及所有的操作都必须在低温条
2、件下进行,2酶作为两性电解质，其结构受pH值的影响。,3.酶和它的底物及其类似物、抑制剂等具有高的亲和性，会使酶的理化性质和稳定性发生一些有利的变化。,4重金属离子可能导致酶的失效，加入适量的螯合剂可有利于保护酶蛋白，避免因重金属离子而导致的变性。,5微生物污染及蛋白酶的存在都可以导致酶被降解破坏，可以通过无菌处理或过滤除去其中的微生物，也可以在酶液中添加防腐剂，如叠氮钠等，同时为了防止蛋白质被蛋白酶降解，可以加入蛋白酶抑制剂,6搅拌时必须缓慢以减少泡沫的形成,7酶蛋白质溶液浓度低，为了避免酶会经常迅速失活，经常在溶液中加入高浓度的其他蛋白质如牛血清白蛋白（BSA）。,（二）酶原料的选择,细胞
3、产生的酶有二类： 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。,A. 了解所分离酶在细胞中分布,B. 材料的获取,在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。当然也要考虑原料的来源、取材方便、经济等因素。,如果目的是研究某一特定组织中的酶，自然无选择材料可言。,由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方
4、法来获得大量的酶制剂。,例如分离纯化超氧化物歧化酶（SOD）、尽管在动物肝、肾、心等器官内含量丰富，而血液含量较少，但考虑到取材容易、价廉及预处理方便等因素，实际应用中还是选择红细胞。,许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎,JY92-II D超声波 细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,（三）生物材料的破碎方法,机械破碎,捣碎法 研磨法 匀浆法,物理破碎,温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tw
5、een,酶促破碎,自溶法 外加酶制剂法,通过机械运动产生的压缩力和剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,生物材料的破碎方法,1机械破碎法：,2物理破碎法,生物材料的破碎方法,3化学破碎法：,生物材料的破碎方法,4酶法破碎：,生物材料的破碎方法,（四）酶的抽提,酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。,抽提方法及抽提液成分
6、,酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂,酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。,提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。,为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。,1.酶的来源不同，抽提的处理方法也有所不同,（1）从动物组织或体液中分离酶蛋白,（2）从植物材料中分离酶蛋白,（3）从微生物中分离酶蛋白,2.影响酶抽提的因素,（1）缓冲液,（2）pH值,（3）温度,（4）盐,（5）抽
7、提液用量,（6）其他,（五）酶的浓缩,提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.11。因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。,1减压蒸发,是采用抽气减压装置使待浓缩酶液在一定真空度下，在60以下的温度进行浓缩的一种方法。由于酶在高温下不稳定，容易变性失活。所以减压蒸发可以再较低温度下使溶液中部分溶剂气化蒸发达到浓缩的目的。,2超滤（ultrafiltration）:浓缩蛋白质的重要方法,超过滤是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜。而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。,（1）平面膜,将膜平铺在多孔支持板上，加压（可带有搅拌）可
8、将水及小分子溶质透过膜孔而排出，而大分子（如酶）被截留。,（2）管式膜,将管式膜置于多孔硬管的外侧或内侧，酶溶液在管内或管外流动，水和分子溶质透过越滤膜，而大分子物质被截留而浓缩。,（3）中空纤维,超滤方法的优点是：无热破坏、无相变化、保持原来的离子强度和pH值，如果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行粗分离，成本也不高，故较为常用。超滤可用于少量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超滤装置可供选择。,凝胶过滤又称为凝胶层析、分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。,3凝胶过滤（gel filtratio
9、n）,凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。,优点是：条件温和，操作简便，也没有pH值与离子强度等的改变，但可能导致蛋白质回收率降低。,4沉淀法,用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，再将沉淀溶解在小体积的样品溶液中。,优点： 浓缩的倍数可以很大 能达到初步纯化的目的 缺点： 往
10、往造成酶蛋白的损失，同时应避免酶的变性失效,5吸附法：,利用聚丙烯酰胺凝胶等能吸水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩。,优点： 条件温和，操作简便，也没有pH值与离子强度等的改变 缺点： 只能用于体积较小的酶抽提液,6透析浓缩法：,将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在密闭容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外，蛋白质即被浓缩。,用聚乙二醇（PEG）涂于装有蛋白质的透析袋上，置于4下，干粉PEG吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。,优点： 条件温和，操作简便，快速有效 缺点： 只能用于小量样品，而且成本很高。,7反复冻融,原理：抽提液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。 方法一：先
11、将溶液冻成冰块，然后使之缓缓融解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液； 方法二：先让酶溶液缓缓冻融，然后再移去形成的冰块。,优点：条件温和，操作简便 缺点：需要大功率的制冷设备 。,8冷冻干燥法,将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后酶呈干粉状。,优点：能使多种酶活性长期保存 缺点：需要冷冻干燥,注意事项：避免抽提液混有有机溶剂 避免抽提液混有磷酸盐,二、酶分离纯化,常用的提纯方法,酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度,（一）根据酶的溶解度进行分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀
12、析出，与其它溶质分离的技术过程。,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。,1.盐析,由于各种酶在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度不同，故可采用分级沉淀法分离酶。,硫酸铵分级沉淀法,硫酸铵分级改进法（反抽提法）,原理 将包括要分离的酶在内的多种蛋白质一起先沉淀出来，然后
13、选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。这种方法的优点在于许多蛋白质从溶液中沉淀析出十分容易，是非特异性的，但反过来，沉淀在溶液中溶解却有相当高的特异性。,Ecoli RNA聚合酶通常在4250硫酸铵饱和度时沉淀。,等电点沉淀法,蛋白质在不同pH下有着不同的溶解度，离等电点越远溶解度度越大，离等电点越近溶解度越小，等电点处溶解度最小。 利用两性电解质在等电点时溶解度低，以及不同的酶蛋白具有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出。,有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为4
14、0。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。,常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,有机溶剂沉淀法,有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。,有机溶剂沉淀法,常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,（二）根据酶的电荷极性进行分离,离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。,离子交换
15、剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。,离子交换层析,原理：当酶蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。,酶纯化过程中常用的离子交换介质,酶纯化过程中常用的离子交换介质,
16、离子交换柱的柱长通常为柱径的45倍。离子交换剂如CM-纤维素或DEAE-纤维素，在装柱前应充分溶胀（在10倍量的蒸馏水中溶胀一夜或在100沸水浴中溶胀1h以上），倾析除去过细粒子，然后用23倍量0.5molL HCl和0.5molL NaOH溶液进行循环转型，每次转型至少维持1015min。对于阳离子交换剂，转型次序为酸一碱一酸，而阴离子交换剂则为碱一酸一碱，经平衡缓冲液平衡，即可进行层析操作。 使用过的离子交换剂可用2molL NaCl彻底洗涤，阳离子交换剂转成H+型或盐型贮存，弱碱性阴离子交换剂以OH-型贮存，中等和强碱性阴离子交换剂以盐型贮存，并且加入适当的保存剂，,表7-4 离子交换剂保存剂,离子交换层析要取得好的效果应注意以下几点： 在上样时加入的蛋白量及样品体积尽可能小，才能得到较高的分辨率。 正确地选择离子交换剂电荷基团，确定是选择阳离子交换剂还是阴离子交换剂，这要取决于被分离的物质在其稳定的pH值下所带的电荷，如果带正电荷，则选择阳离子交换剂；如带负电荷，则选择阴离
