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1、第四节 噬菌体抗体工程,20世纪80年代中期以来抗体工程技术得到突破性进展，目前抗体库筛选技术包括噬菌体抗体库 合成抗体库 和核糖体展示技术。特别是噬菌体随机表面文库技术的建立和发展促使了噬菌体抗体库技术的生产.1991年Barbas等报道了噬菌体抗体库技术,这一技术使抗体表达,扩增和筛选更为有效.,噬菌体抗体库是 丝状噬菌体展示技术和 抗体组合文库技术 的结合,为人源抗体的制备提供了新途径,可视为抗体工程史的里程碑.,利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和洗脱扩增亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其
2、编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。,一 噬菌体展示的基本原理,Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface . Science ,1985 ,228 :1315 - 1317.,1985年Smith首次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外
3、壳蛋白一起展示在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。,1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g 融合展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。,Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands wit h an epitope library. Science , 1990 ,249 :386.,噬菌体展示技术的突破,噬菌体可以是单股DNA (如M 13、fd 和f1)、双股DNA (如 噬菌体)、双股RNA (如f6) 或单股RNA (如M S2 和Q B)。噬菌体在自然环境中普遍存在, 数量和种类远多于细菌。,噬
4、菌体是细菌病毒, 在与宿主细胞特异性受体结合并注入其DNA 后, 能将其DNA 整合进宿主基因组(溶原性) , 或用于合成新的噬菌体颗粒。在真核宿主中, 噬菌体不能复制, 如无合适的原核宿主, 噬菌体如同无生命的颗粒性抗原。,噬菌体展示技术及其应用,噬菌体展示技术（Phage Display techniques，PDT）起源于1985年,是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域。,目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究
5、开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响,在临床上接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病毒感染的抵抗力增强, 噬菌体能上调感染病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清肿瘤坏死因子(TNF-) 水平, 体外加入噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-和白细胞介素6水平。IL-6 涉及Th2 型应答, 对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。总之, 这些结果表明噬菌体能作为细胞和体液免疫的天然佐剂。,噬菌体展示技术的概论,目前，能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统有丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。,噬菌体表达系统,T7 噬菌体
6、基因组由39936bp双链线性DNA组成，有160bp 的突出末端。T7噬菌体衣壳蛋白通常有2 种形式，10A（344氨基酸）和10B（397氨基酸），10B是在10A的341个氨基酸的翻译框中产生的(translational frameshift)，约占衣壳蛋白的10%，功能性衣壳或者由10A、或者由10B、或者由10A和10B以一定比例构成，这说明T7衣壳蛋白能够容纳变异体。独特的10B 衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用作噬菌体展示。不像丝状噬菌体系统，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。T7展示系统可以高、中、低拷贝地展示不同分子
7、量的蛋白质，是目前最为理想的展示系统。,Vector Cloning Regions Of T7 Select10-3b,与传统的质粒DNA疫苗相比,利用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具有独特的优势：噬菌体传递的DNA 疫苗诱生的抗体应答持续时间更长, 滴度更高；噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能直接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫效果。还体现于甚至在病原体不够确定、极度危险或不易获得的情况下,如研制SARS(又称“非典型肺炎”) 疫苗,同样可通过获得特异性抗病原体抗体进行肽库筛选,设计有效、
8、特异、安全的模拟肽疫苗,具有抗烈性传染病疫苗设计的巨大优势。,噬菌体展示技术研制基因工程疫苗的优劣,噬菌体展示疫苗十分有希望, 但其技术存在一定的内在的限制性, 例如, 在传递噬菌体衣壳蛋白-疫苗肽融合体时, 不是所有的构象活性表位都能被保留下来？此外，噬菌体生长于原核细胞，因此噬菌体疫苗将缺少真核细胞翻译后的糖基化信号。,二 噬菌体抗体库的种类,根据抗体基因来源组成的不同,抗体文库大致可分为4 种: 天然抗体文库(native antibody library) ,抗体基因片段来自未经免疫的供体,该文库代表了供体内天然的抗体谱; 免疫后抗体文库(Immunized antibody Libr
9、ary) ,抗体基因片段克隆自经抗原免疫过的供体,该文库一般具有较强的抗原特异性和亲和力; 半合成抗体文库( Semi-synthetic antibody Library) ,该文库抗体重链可变区基因片段中CDR1 和CDR2 来自人胚系VH 片段,而CDR3 则是人工合成的编码515个氨基酸的随机序列,该文库容量极大,可达1012 ,但抗体的亲和力较低,同时人工合成的CDR3 可能增加抗体的免疫原性; 合成抗体库,是在对人或鼠抗体的序列和主体结构进行分析的基础上,合成多条VH 和VL 基因,用来替代所有的抗体类别和结构,组成多个总抗体库,其CDR 区可通过限制酶方便地更换,该库便于进行分子
10、模拟和结构预测,不足之处是操作复杂,且所获得抗体的免疫源性往往较高。,噬菌体抗体库综合运用了3 项实验技术,RT-PCR 技术,使人们可以用一组引物克隆出全套免疫球蛋白可变区基因; 成功地采用大肠杆菌分泌表达具有生物活性的抗体功能片段; 噬菌体表面展示技术的建立,目前建库采用较多的噬菌体载体是pComb3 及pCANTABLE ,其主要技术流程是,先从脾或外周淋巴细胞等提取RNA ,采用与抗体可变区基因两侧保守区互补的引物,通过RT-PCR 分离扩增抗体的轻、重链基因片段,再经过随机重排组合,将基因片段克隆噬菌体载体中,组成噬菌体抗体文库,库中每一个噬菌体在其表面可表达一种特异性抗体(Fab
11、或ScFv) 。,噬菌体抗体库表达载体,噬菌体 -菌斑印迹筛选克隆,外源性片断不能大,库容量小 单链丝状噬菌体-是载体中包含单价及多价两个子系统,可筛选出高亲和力抗体. 噬菌粒-应用最多表达载体,能高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统.,噬菌体抗体库的构建方法,免疫球蛋白基因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞（骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁挑体或经过免疫的小鼠脾脏等），其中以淋巴结的B淋巴细胞较好。 建库的过程是：先提取细胞总RNA，进行RT-PCR扩增可变区基因，运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达载体进行酶切，再对切割产物进行分离纯化，
12、按一定比例将载体和轻链连接，转化感受态细菌并扩大培养，提取质粒即为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接，转化感受态细胞，加入辅助噬菌体培养，离心取上清液，加入PEG沉淀并收集噬菌体颗粒即得到噬菌体总抗体库。,一 mRNA的来源 1,杂交瘤细胞 2,免疫淋巴细胞或骨髓中的浆细胞 3,未经免疫的B淋巴细胞 二 抗体基因的扩增 三 抗体基因的克隆 四 筛选 1,表位筛选 2,功能性筛选 3,选择性感染筛选,噬菌体抗体库优点及应用前景,优点 1 噬菌体抗体技术可建相当量库容的抗体库. 2 噬菌体抗体技术无需免疫动物. 3 适合大规模工业化生产. 4 噬菌体抗体库能够模拟天
13、然抗体库. 5 抗体表型和基因型一致. 6 筛选噬菌体抗体库,在免疫系统中,抗体亲和力成熟过程是多样性B细胞群在抗原“压力”选择下发生分化,抗体可变区基因发生大量突变,抗原特异性B 细胞克隆进一步增殖分化,而非特异性克隆则发生凋亡或处于增殖劣势,最终产生高亲和力抗体。噬菌体抗体库技术可以通过多条途径,模拟上述免疫系统抗体亲和力成熟过程。 其一,提高抗体库的质量,可选用经免疫应答反应后的抗体基因构建高特异性抗体库,或构建高库容量抗体库。 其二,突变技术的运用,可有目的地进行氨基酸替换(定点突变) 、PCR 错配以及大肠杆菌突变株对抗体可变区基因进行大量随机突变,再从中筛选高亲和力抗体. 其三,链
14、替换,即通过抗体库内的重、轻链基因重新配对,增加抗体库的多样性,这样可大大提高筛选出高亲和力抗体的机会。尽管提高抗体亲和力的新技术不断出现,然而如何有效获得高亲和力抗体仍是抗体库研究的核心课题之一,也是基因工程抗体能否应用的关键.,第五节 转基因动物表达抗体,人源抗体（human antibody）转基因鼠表达系统正是针对目前鼠源抗体临床应用存在的严重问题而提出的，其目的是通过人工染色体操作、染色体同源重组、较大片段DNA原核注射等关键技术平台的建立，再结合基因剔除技术，最终建成仅产生人Ig而无鼠内源相关基因表达的转基因鼠品系。,一 分泌完全人源抗体基因鼠的建立,人淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞,融合
15、,分泌人型Ig,1 人鼠型杂交瘤细胞,最终丢失 人的染色体,2 人型杂交瘤细胞,人致敏淋巴细胞 人骨髓瘤细胞,融合,分泌人型Ig,技术困难,3 噬菌体展示技术,原始人Ig基因库中产生的抗体片断没有经过天然的抗体的成熟过程,故亲和力低,而且需要复杂的抗体基因工程技术和多轮筛选才能获得.另外,该技术生产的抗体片断还需与抗体的缺失部分连接以产生一个完整的抗体.,4 1994年美国Cell Genesys公司和Genpharm公司通过人的免疫球胆白基因替代鼠的同类基因使鼠能在接受人抗原免疫后分泌人抗体,转基因小鼠作为安全的人抗体载体获成功. 人抗体基因位点转入小鼠体内,分泌人抗体的转基因小鼠. 其前提
16、是人的抗体基因片断在小鼠体内进行重排并表达,并且这些片断能与小鼠细胞的信号机制相互作用,即抗原刺激后,这些片断可被选择,表达并活化B细胞分泌人抗体. 利用基因打靶技术,将编码人抗体轻重链的基因片断全部转到自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中,再经过繁育筛选,建立了稳定的转基因小鼠品系.,人源化抗体技术,荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）,1 微基因重组子技术 把人Ig基因组中间断存在的基因片断连在一 起,分别组建成轻,重链微基因,随后将这些构建的微基因质粒注入小鼠胚胎原核中,从而获得了含有人重链和轻链的转基因鼠. 2 微胞干细胞杂交技术 (ES microcellhybride) 3 酵母人工染色体 (YAC yeast artificial chromosome).,二 小鼠生产完全人源抗体的机制,杂交瘤技术,人源化抗体 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体.,第六节 抗体工程在制
