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1、第四章 电泳技术 Electrophoresis,1,内容提纲,凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳技术 毛细管电泳技术,2,一、定义,电泳：带电粒子在直流电场中向着与其本身所带电荷电性相反的电极移动的现象。,第一节 电泳技术概论,3,二、电泳的基本原理,悬浮或溶解在电解质溶液中的带电粒子，在电场作用下以不同的速度向着与自身所带电荷极性相反的电极移动。在电泳过程中，带正电荷的粒子向电场的负极方向移动，带负电荷的粒子向电场的正极方向移动。移动的带电粒子受到电场力和周围介质阻力的作用，当二力平衡时，粒子以稳定的速度向电极方向移动。由于电荷、质量等的差异，粒子将会有不同的质/荷比，使其在电场中具有不同的
2、迁移速度。,4,基本原理,5,V q M = = E 6r,迁移率（Mobility) 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。,6,三、影响电泳速度的因素,1. 电场强度（E）,E电流热效应支持介质上的水分蒸发样品的热变性 E电泳速度慢延长电泳时间样品扩散区带模糊不清分辨率下降,7,电场强度愈高，带电粒子受到的电场力就愈大，粒子移动速度愈快,溶液的I越高，带电粒子的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。 I缓冲能力越大缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢,2. 缓冲液,（m：离子的摩尔浓度，Z：离子的价数）,对于稀溶液：,8,两性物质解离性质及等电点（pI）,NH2,(pK
3、1),(pK2),等电点 (isoelectric point)：蛋白质是两性电解质，在某一特定pH值时，蛋白质分子上所带正负电荷相等，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值称该蛋白质的pI 。,9,3. 支持介质,电渗 指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。 分子筛 介质在交联过程中形成孔径不同的凝胶。小分子颗粒泳动过程中受的阻力小，速度快。,10,4. 样品的物理性状,样品的物理性状是指样品分子的大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。,四、电泳分析技术发展概况,1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 19
4、59年 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1980s 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis),Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 蒂塞利乌斯(瑞典人)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖,1948,11,五、电泳分析技术的分类,1. 根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2. 根据电泳电压的高低 常压电泳 100500 V 高压电泳 50010kV,12,滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 丝状电泳，如尼
5、龙丝、人造丝电泳,3. 根据电泳中是否使用支持物,自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳使用支持物,(1) 按支持物的物理性状不同，可分为,13,(2) 按支持物的装置形式不同，可分为 平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳,14,连续pH电泳指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳。 不连续pH电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段有不同的pH，如 PAGE、IFE。 优点：在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。,4. 根据电泳系统pH是否连续，可分为,15,六、电泳技术的特点,凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分 离,并可
6、进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高.,16,七、电泳技术应用,临床诊断 进行血清蛋白、血红蛋白、精蛋白、脂蛋白的分离、鉴定和含量测定以及血清学酶的检验、免疫化学检验等。 工业制造 用于提纯酶、激素及其它生化产品 基础理论研究,从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。,17,支持物：多孔凝胶。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高。
7、,凝胶电泳 是指用凝胶物质作为支持介质的电泳方法。,最常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 优点：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。,18,第二节 凝胶电泳,分离核酸基本原理 pH为8.08.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的琼脂糖作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。,一、琼脂糖凝胶电泳,19,琼脂糖的浓度 缓冲液：有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。 嵌入染料 电泳温度 电压 核酸分子大小
8、及构象,20,影响核酸迁移率的因素,配置融化琼脂糖,安装梳齿,加入染料,拔除梳齿,加入电泳缓冲液,上样并电泳,紫外灯下观察,21,琼脂糖凝胶电泳的基本操作步骤,加样缓冲液的作用： （1）增加样品密度 （2）呈现颜色，便于操作 （3）观察电泳情况,常用仪器设备,琼脂糖凝胶电泳分离核酸,22,常用仪器设备,琼脂糖凝胶电泳分离核酸,23,聚丙烯胺凝胶（ polyacrylamide gel ）是由丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）催化的。,24,二 、聚丙烯酰胺凝胶电泳,添加尿素、甲酰胺、SDS等解离剂,基本原理 SDS 即十二烷
9、基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键 。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,25,十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳不受蛋白质原有电荷影响，主要取决于蛋白质及其亚基分子量大小，可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。,26,SDS-PAGE是一个不连续系统，由上层浓缩胶和下层的
10、分离胶组成。 浓缩胶（pH6. 8，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。 分离胶（pH8. 8，孔径小）通过分子筛效应，把样品中的各组分按分子量大小而分开。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,27,SDS-PAGE的有效分离范围,考马斯亮染色 硝酸银染色,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,28,丙烯酰胺有神经毒性，勿接触皮肤 玻璃板光滑洁净，以便于凝胶取下和灌胶时产生气泡 妥善安装制胶板，避免液体渗漏，可用琼脂糖或胶带封边 灌胶和插入梳子时，应止气泡产生 拔出梳子时，用纯水清洗加样孔,【注意事项】,29,蛋白质具有
11、许多可解离的酸性基团（COOH）和碱性基团（NH2）及其它基团，在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质分子在不同pH下的解离状态,30,（三）等电聚焦电泳,31,等电聚焦电泳（IEF） 是指电泳系统中加入两性电解质载体，当通以直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。样品（蛋白质等）进入时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。,（四）双向电泳,双向电泳（two - dimensional electrophoresis，2-DE）广义定义是将样品进行电泳后针对不同目的在它的直角方向再进行一次电泳。目前双向电泳大多是指第一向为等电聚焦，第二向为SDS-PAGE电泳。,32,33,
